Uyarılmış, Spontan ve Minyatür Synaptic Faaliyetleri Sırasında FM boyalar kullanarak sinaptik vezikül Geri Dönüşüm Sınavı
Summary
Fonksiyonel sinir terminallerinin sinaptik vezikül görüntü geri dönüşüm için stiril FM boyaların kullanımını tarif eder. Bu protokol, sadece uyarılmış için değil, aynı zamanda doğal ve minyatür sinaptik faaliyetleri uygulanabilir. Protokol etkili değerlendirilebilir sinaptik olayların çeşitli genişletir.
Abstract
Fonksiyonel sinir terminalleri sinaptik kesecikler ekzositoz ve endositoz tabi. Bu sinaptik vezikül geri dönüşüm etkili membran ciro ortaya styryl FM boyalar kullanılarak analiz olabilir. FM boyaların kullanılması için geleneksel protokolleri uyarılmış (uyarılmış) sinaptik etkinliği aşağıdaki nöronlar analiz etmek için tasarlanmıştır. Son zamanlarda, bu tür protokoller spontan veya minyatür sinaptik olaylar gibi zayıf sinaptik faaliyetleri, eşlik FM sinyallerini analiz için kullanılabilir hale gelmiştir. FM sinyalleri, bu küçük değişikliklerin analizi görüntüleme sistemi, yoğunluğu küçük değişiklikler tespit etmek için yeterince duyarlı olan, ancak büyük genlikli bu suni bastırılmış değişiklikler gerektirir. Burada, uyarılmış spontan ve minyatür sinaptik faaliyetleri, ve bir örnek olarak kültürlü hipokampal nöronlar kullanmak için uygulanabilir bir protokol açıklar. Bu, önemli olduğu için bu protokol, aynı zamanda, boyaların FM ışıkla ağartma oranını değerlendirmek için bir araç içeriryoğunluğundaki küçük değişiklikler görüntüleme eserler kaynağıdır.
Introduction
Sinaptik veziküllerin işlevi sinaptik iletim önemli bir belirleyicisidir. Bunların presinaptik plazma zarı (ekzositozu) ile kaynaştırmak zaman bu veziküller nörotransmitter serbest bırakmak ve bunlar plazma zarı (endositoz) rejenere edilmiş ve nörotransmitter ile yeniden sonra serbest bir çevrimi için hazır hale gelir. Dinamikleri ve sinaptik vezikül geri dönüşüm altında yatan mekanizmaları içine Araştırma ölçüde Stiril FM boyaların 1 tanıtımı ile birlikte ivme kazanmıştır. Pozitif (Şekil 1A, Şekil 1B FM1-43 StereoView birden boyalar) hidrofilik baş grupları ve hidrofobik kuyrukları ücret bu amfipatik moleküller, tersine çevrilebilir girmek ve onları nüfuz etmeden lipid membranlar çıkabilirsiniz. FM boyaların grupları yaydıkları ışık aralığını etkileyen benzer özellikler taşırlar. Örneğin, FM2-10, FM1-43 ve-84 FM1 iki siklik bileşikler ve sho arasında bir çift bağa sahipw yeşil emisyon. Aralarındaki fark, hidrofob belirler ve bu nedenle zardan çıkış hızı (departitioning), hidrofobik kuyruk uzunluğudur. FM5-95 ve FM4-64 durumlarda, üç çift bağlar siklik bileşikler bağlamak ve onlar kırmızı emisyon göstermektedirler. Bu boyalar, hidrofilik kısmına göre değişir. Vadesi hidrofilik çevreye hidrofobik ortam göreceli olarak kuantum veriminde bir artışa bağlı olarak, biyolojik zarların içine sokulur, tüm FM boyalar olarak, floresan yoğunluğu artar. Böylece FM şiddetindeki değişiklikler membran ciro değişiklikleri temsil eder. Farklı renk (emisyon spektrumları) ve hidrofobluğa FM sinaptik vezikül geri dönüşüm çok yönlü bir araştırma aracı boyar yapmak.
Bu özelliklere bağlı olarak, FM boyalar çok sinaptik vezikül geri dönüşüm analiz aşağıdaki şema (Şekil 2) uygun olarak kullanılmaktadır. NöronBu endositoz (boyama) yoluyla meydana olarak s sinaptik vesiküller (SVS) içine alınacak etkinleştirme, FM, boyayı ihtiva eden bir hücre dışı çözelti içinde banyo edilir. Daha sonra boya, boya içermeyen hücre dışı çözelti uygulanması ile yıkanır, bu, yani yalnızca aktif geçiren endositoz boya (Şekil 2, alt) ile yüklenir sinaptik veziküllerin bir küme içerir işlevsel sinir terminalleri, ortaya koymaktadır. Sonraki ekzositozu hücre dışı alanı için FM boya kaybı ve floresan bir eşlik eden kaybına neden olur (destaining, nedeniyle bir hidrofilik çevreye departitioning ve uzak ekzositoz sitesinden difüzyon hem de). Bu nedenle FM floresan yoğunluğundaki değişiklikler sinaptik vezikül ekso-ve endositoz göstergeleridir.
FM boyalar, çeşitli organizmalar ve preparatlar 2,3 sinaptik veziküllerin leke ve destain için kullanılmıştır. Örnekler memeli Neur dahilÖnal kültürleri 4-9, memeli beyin dilimleri 10,11, nöromüsküler kavşakları 12,13, retina bipolar nöronlar 14,15 ve kokleanın 16 saç hücreleri.
Genellikle bu tür deneylerde, boyama ve destaining hem yoğun nöron (uyarılmış aktivite) uyararak tetiklenir. Bir dış etmenin etkisi ile (kendiliğinden ve minyatür sinaptik aktivite) 9,17-19 yokluğunda olduğu gibi geri dönüşüm Ancak son zamanlarda, zayıf bir uyarıya yanıt olarak sinaptik vezikül geri dönüşüm aynı zamanda, analiz edilmiştir. Spontan ve minyatür sinaptik faaliyetleri hareket potansiyellerinin kendiliğinden ateş (Şekil 3) içeren önceki ile, dış uyaranların yokluğunda meydana olanlar olarak tanımlanmaktadır. Bu zayıf sinaptik faaliyetleri geniş uyarılmasıyla tetiklenen daha FM sinyalleri olarak daha küçük değişikliklerle ilişkilidir. Ölçüm gerektirir FM fluoresc değişimlerence yoğunluğu doğru sinaptik vezikül eksositosizini veya endositozu ama yoğunluğu yapay olmamasını değişiklikleri yansıtacak. Dışlayıcı bir nedeni FM boyalar ile, plazma zarının spesifik olmayan lekelenme varlığıdır. Bu bileşenin kademeli yıkama hatalı sinaptik faaliyetleri atfedilen edilecek ölçülen floresan yoğunluğunda kademeli bir değişim, yol açacaktır. Bu faktör (Protokolü bakınız) uygun yöntemlerle azaltılabilir. Dışlayıcı en önemli nedeni sinaptik keseler içinde tutulan FM boya photobleaching olduğunu. FM yoğunluğu ışıkla ağartma ilgili değişiklikler ölçülür biyolojik (sinaptik) değişikliklere göre küçük olmalıdır. Hassas kameralarının son gelişmeler, örneğin, elektron-çarparak şarj-kuplajlı aygıt (EMCCD) kamera, mümkün maruz kalma süresini kısaltarak ve fluorofor uyarmak için kullanılan ışığın yoğunluğunu zayıflatarak ışıkla ağartma en aza indirdiği bulunmuştur. Dışlayıcı bir başka nedeni bir sürüklenme in ışık mikroskobu odaklama seviyesi. Bir görüntüleme oturumu sırasında odak kayması mekanik ya da termal etkilere neden olabilir ve hatalı ölçülen floresan yoğunluğunda bir değişikliğe yol açacaktır.
Burada, bu durum özellikle, minyatür sinaptik etkinliği, daha zayıf ya da herhangi bir stimülasyon bağlamında sinaptik vezikül geri dönüşüm analiz etmek için FM boyaların kullanımı gerekli protokolleri ve donanım tarif etmektedir. Biz kültürlü kemirgen hipokampal nöronlar kullanarak ve destaining faz görüntüleme, uyarılmış ve spontan sinaptik olaylar sırasında veziküllerin boyama ve destaining örneklerini göstermektedir. Biz de sinaptik faaliyetleri herhangi bir FM boya kaybı yokluğunda, FM boya ağartmanın derecesini değerlendirmek nasıl gösterilmektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz, spontan ve minyatür sinaptik aktivite uyarılmış ve destaining aşamasında görüntüleme için yanıt sinaptik veziküller boyama ve lekenin için protokoller tanımlamışlardır. Mevcut protokoller ek olarak, minyatür sinapsis aktivitesine dayandığı FM destaining gözlemleme yeni bir protokol dahil ettik. Bu protokolleri kullanarak, önceden hareket bozukluğu distoni bir fare modeli kültürlü nöronlar anormallikleri tespit. Yüksek etkinlik 20 ile uyarıldığında, vahşi tip farelerde mu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, bu çalışmanın yürütülmesi boyunca yararlı tartışmalar için harata laboratuar üyelerine teşekkür ederim. Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği, distoni Tıbbi Araştırma Vakfı, Edward Mallinckrodt, Jr Vakfı, Ulusal Bilim Vakfı ve NCH için Whitehall Vakfı hibe tarafından finanse edildi
Materials
| Pulse generator | AMPI | Master-8 | |
| Isolated stimulator | Digitimer | DS3 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100 | This is used for assessing the cell morphology at low magnification. |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TiE | This is used for high-resolution fluorescence and transmitted light imaging, with minimal focus drift. |
| Objective lens | Nikon | Water-immersion lens is recommended. Oil-immersion lens is usable unless an imaged structure is deep from the coverslip surface (e.g. >10 μm). | |
| Filter cube | Nikon | 77032509 | 490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em for FM1-43 |
| Filter cube | Nikon | 77032809 | 490/20-nm ex, 510-nm dclp, 650-nm-LP em for FM4-64. |
| EMCCD camera | Andor Technology | iXon EM+ DU-860 | This EMCCD camera is used for high-sensitivity detection of fluorescence. |
| Liquid recirculating chiller | Solid State Cooling Systems | Oasis 160 | This is used for continuously perfusing the camera with chilled water for maintaining a temperature of -80°C, and thereby reducing noise. |
| LED | CoolLED-Custom Interconnect | 490 nm | This light source is used for rapid on/off control of fluorescence excitation. |
| Image acquisition software | Andor Technology | Solis | |
| Imaging chamber | Warner Instruments | RC-21BRFS | |
| Fast perfusion system | Warner Instruments | SF-77B | |
| CNQX | Tocris Bioscience | 1045 | |
| D,L-AP5 | Tocris Bioscience | 0106 | |
| Tetrodotoxin | Tocris Bioscience | 1069 | Caution: toxic reagent. Handle with care. |
| FM1-43 | Invitrogen | T35356 | |
| Aldehyde-fixable FM1-43 (FM1-43FX) | Invitrogen | F35355 | |
| FM4-64 | Invitrogen | T13320 | |
| Aldehyde-fixable FM4-64 (FM4-64FX) | Invitrogen | F34653 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| Hanks’ balanced salt | Sigma-Aldrich | H2387 | |
| Minimum Essential Medium | Invitrogen | 51200-038 | This solution does not contain phenol red that will interfere with fluorescence imaging. |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Caution: toxic reagent. Handle with care. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 |
References
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
- Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nat. Protoc. 1, 2916-2921 (2006).
- Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. . Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes. , 77-83 (2012).
- Newton, J., Murthy, V. Measuring exocytosis in neurons using FM labeling. J. Vis. Exp. , (2006).
- Evans, G. J., Cousin, M. A. Simultaneous monitoring of three key neuronal functions in primary neuronal cultures. J. Neurosci. Methods. 160, 197-205 (2007).
- Cousin, M. A. Use of FM1-43 and other derivatives to investigate neuronal function. Curr. Protoc. Neurosci. 2, (2008).
- Clayton, E. L., Cousin, M. A. Quantitative monitoring of activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicle membrane by fluorescent dextran imaging. J. Neurosci. Methods. 185, 76-81 (2009).
- Cheung, G., Cousin, M. A. Quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using FM dyes. J. Vis. Exp. , (2011).
- Welzel, O., Tischbirek, C. H., Kornhuber, J., Groemer, T. W. Pool-independent labelling of synaptic vesicle exocytosis with single vesicle resolution in rat hippocampal neurons. J. Neurosci. Methods. 205, 258-264 (2012).
- Winterer, J., Stanton, P. K., Muller, W. Direct monitoring of vesicular release and uptake in brain slices by multiphoton excitation of the styryl FM 1-43. Biotechniques. 40, 343-351 (2006).
- Kay, A. R. Imaging FM dyes in brain slices. Cold Spring Harb. Protoc. , (2007).
- Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods Mol. Biol. 440, 349-369 (2008).
- Amaral, E., Guatimosim, S., Guatimosim, C. Using the fluorescent styryl dye FM1-43 to visualize synaptic vesicles exocytosis and endocytosis in motor nerve terminals. Methods Mol. Biol. 689, 137-148 (2011).
- Guatimosim, C., von Gersdorff, H. Optical monitoring of synaptic vesicle trafficking in ribbon synapses. Neurochem. Int. 41, 307-312 (2002).
- Joselevitch, C., Zenisek, D. Imaging exocytosis in retinal bipolar cells with TIRF microscopy. J. Vis. Exp. , 1305 (2009).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22, 3939-3952 (2002).
- Sara, Y., Virmani, T., Deak, F., Liu, X. An isolated pool of vesicles recycles at rest and drives spontaneous neurotransmission. Neuron. 45, 563-573 (2005).
- Wilhelm, B. G., Groemer, T. W., Rizzoli, S. O. The same synaptic vesicles drive active and spontaneous release. Nat. Neurosci. 13, 1454-1456 (2010).
- Kakazu, Y., Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Miniature release events of glutamate from hippocampal neurons are influenced by the dystonia-associated protein torsinA. Synapse. 66, 807-822 (2012).
- Kakazu, Y., Koh, J. Y., Ho, K. W., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Synaptic vesicle recycling is enhanced by torsinA that harbors the DYT1 dystonia mutation. Synapse. 66, 453-464 (2012).
- Kavalali, E. T., Klingauf, J., Tsien, R. W. Activity-dependent regulation of synaptic clustering in a hippocampal culture system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 12893-12900 (1999).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
- Nosyreva, E., Kavalali, E. T. Activity-dependent augmentation of spontaneous neurotransmission during endoplasmic reticulum stress. J. Neurosci. 30, 7358-7368 (2010).
- Ryan, T. A., Smith, S. J. Vesicle pool mobilization during action potential firing at hippocampal synapses. Neuron. 14, 983-989 (1995).
- Ryan, T. A., Smith, S. J., Reuter, H. The timing of synaptic vesicle endocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 5567-5571 (1996).
- Harata, N., et al. Limited numbers of recycling vesicles in small CNS nerve terminals: implications for neural signaling and vesicular cycling. Trends Neurosci. 24, 637-643 (2001).
- Klingauf, J., Kavalali, E. T., Tsien, R. W. Kinetics and regulation of fast endocytosis at hippocampal synapses. Nature. 394, 581-585 (1998).
- Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J. Cell Biol. 168, 929-939 (2005).
- Kay, A. R., et al. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat. Neuron. 24, 809-817 (1999).
- Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. An ultrastructural readout of fluorescence recovery after photobleaching using correlative light and electron. 1, 988-994 (2006).
- Moulder, K. L., Jiang, X., Taylor, A. A., Benz, A. M., Mennerick, S. Presynaptically silent synapses studied with light microscopy. J. Vis. Exp. , (2010).
- Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of synaptic activity in hippocampal slices with FM1-43 enabled by fluorescence quenching. Neuron. 24, 803-808 (1999).
- Harata, N. C., Choi, S., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Frequency-dependent kinetics and prevalence of kiss-and-run and reuse at hippocampal synapses studied with novel quenching methods. Neuron. 49, 243-256 (2006).
- Piedras-Renteria, E. S., et al. Presynaptic homeostasis at CNS nerve terminals compensates for lack of a key Ca2+ entry pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 3609-3614 (2004).
- Rosenmund, C., Stevens, C. F. Definition of the readily releasable pool of vesicles at hippocampal synapses. Neuron. 16, 1197-1207 (1996).
- Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Piedras-Renteria, E. S., Tsien, R. W. Rapid reuse of readily releasable pool vesicles at hippocampal synapses. Neuron. 28, 221-231 (2000).
- Kawano, H., et al. Long-term culture of astrocytes attenuates the readily releasable pool of synaptic vesicles. PLoS ONE. 8, (2012).
- Harata, N., Katayama, J., Takeshita, Y., Murai, Y., Akaike, N. Two components of metabotropic glutamate responses in acutely dissociated CA3 pyramidal neurons of the rat. Brain Res. 711, 223-233 (1996).
- Kira, T., Harata, N., Sakata, T., Akaike, N. Kinetics of sevoflurane action on GABA- and glycine-induced currents in acutely dissociated rat hippocampal neurons. Neuroscience. 85, 383-394 (1998).
- Harata, N., Katayama, J., Akaike, N. Excitatory amino acid responses in relay neurons of the rat lateral geniculate nucleus. Neuroscience. 89, 109-125 (1999).
- Albeanu, D. F., Soucy, E., Sato, T. F., Meister, M., Murthy, V. N. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS ONE. 3, e2146 (2008).
- Neves, G., Lagnado, L. The kinetics of exocytosis and endocytosis in the synaptic terminal of goldfish retinal bipolar cells. J. Physiol. 515, 181-202 (1999).
- Mazzone, S. B., et al. Fluorescent styryl dyes FM1-43 and FM2-10 are muscarinic receptor antagonists: intravital visualization of receptor occupancy. J. Physiol. 575, 23-35 (2006).
- Gale, J. E., Marcotti, W., Kennedy, H. J., Kros, C. J., Richardson, G. P. FM1-43 dye behaves as a permeant blocker of the hair-cell mechanotransducer channel. J. Neurosci. 21, 7013-7025 (2001).
- Li, D., Herault, K., Oheim, M., Ropert, N. FM dyes enter via a store-operated calcium channel and modify calcium signaling of cultured astrocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21960-21965 (2009).
- Crumling, M. A., et al. P2X antagonists inhibit styryl dye entry into hair cells. Neuroscience. 161, 1144-1153 (2009).
- Zhu, Y., Stevens, C. F. Probing synaptic vesicle fusion by altering mechanical properties of the neuronal surface membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 18018-18022 (2008).
- Thiagarajan, T. C., Lindskog, M., Tsien, R. W. Adaptation to synaptic inactivity in hippocampal neurons. Neuron. 47, 725-737 (2005).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Li, H., et al. Concurrent imaging of synaptic vesicle recycling and calcium dynamics. Front. Mol. Neurosci. 4, 34 (2011).
- Raingo, J., et al. VAMP4 directs synaptic vesicles to a pool that selectively maintains asynchronous neurotransmission. Nat. Neurosci. 15, 738-745 (2012).
- Martens, H., et al. Unique luminal localization of VGAT-C terminus allows for selective labeling of active cortical GABAergic synapses. J. Neurosci. 28, 13125-13131 (2008).
- Hua, Y., Sinha, R., Martineau, M., Kahms, M., Klingauf, J. A common origin of synaptic vesicles undergoing evoked and spontaneous fusion. Nat. Neurosci. 13, 1451-1453 (2010).
- Hua, Y., et al. A readily retrievable pool of synaptic vesicles. Nat. Neurosci. 14, 833-839 (2011).
- Groemer, T. W., Klingauf, J. Synaptic vesicles recycling spontaneously and during activity belong to the same vesicle. 10, 145-147 (2007).
- Moulder, K. L., et al. A specific role for Ca2+-dependent adenylyl cyclases in recovery from adaptive presynaptic silencing. J. Neurosci. 28, 5159-5168 (2008).
- Crawford, D. C., Jiang, X., Taylor, A., Moulder, K. L., Mennerick, S. Differential requirement for protein synthesis in presynaptic unmuting and muting in hippocampal glutamate terminals. PLoS ONE. 7, (2012).
- Henkel, A. W., Lubke, J., Betz, W. J. FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 1918-1923 (1996).
- Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM 1- 43 photoconversion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 12748-12753 (2001).
- Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying synaptic vesicle pools using photoconversion of styryl dyes. J. Vis. Exp. , (2010).
- Schikorski, T. Monitoring rapid endocytosis in the electron microscope via photoconversion of vesicles fluorescently labeled with FM1-43. Methods Mol. Biol. 657, 329-346 (2010).
- Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. FM dye photoconversion for visualizing synaptic vesicles by electron microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2012, 84-86 (2012).
- Schote, U., Seelig, J. Interaction of the neuronal marker dye FM1-43 with lipid membranes. Thermodynamics and lipid ordering. Biochim. Biophys. Acta. 1415, 135-146 (1998).
- Harata, N. C., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Kiss-and-run and full-collapse fusion as modes of exo-endocytosis in neurosecretion. J. Neurochem. 97, 1546-1570 (2006).
