Examen de la vésicule synaptique recyclage utilisant des colorants FM Pendant évoqués, spontanée, et les activités synaptiques miniatures

Summary

Nous décrivons l'utilisation de colorants styryles FM à l'image synaptique recyclage des vésicules dans les terminaisons nerveuses fonctionnelles. Ce protocole peut être appliqué non seulement à évoquer, mais aussi spontané et activités synaptiques miniatures. Le protocole élargit le choix des événements synaptiques qui peuvent être évaluées de manière efficace.

Abstract

Les vésicules synaptiques dans les terminaisons nerveuses fonctionnelles subissent l'exocytose et l'endocytose. Ce recyclage des vésicules synaptiques peut être efficacement analysé en utilisant des colorants styryle FM, qui révèlent le chiffre d'affaires de la membrane. Des protocoles classiques pour l'utilisation de colorants FM ont été conçus pour l'analyse suivante neurones stimulée (évoqué) l'activité synaptique. Récemment, les protocoles sont devenues disponibles pour l'analyse des signaux FM qui accompagnent les activités synaptiques plus faibles, tels que les événements spontanés ou décoratifs synaptiques. L'analyse de ces petits changements dans les signaux FM nécessite que le système d'imagerie est suffisamment sensible pour détecter de petites variations de l'intensité, pour l'instant que les changements d'artefact de grande amplitude sont supprimées. Nous décrivons ici un protocole qui peut être appliquée à évoqué, spontanée, et les activités synaptiques miniatures, et en utilisant des neurones hippocampiques en culture, par exemple. Ce protocole comporte également un moyen d'évaluer le taux de photoblanchiment des colorants FM, comme il s'agit d'une importantesource d'artefacts lors de l'imagerie de petits changements dans l'intensité.

Introduction

La fonctionnalité des vésicules synaptiques est un déterminant important de la transmission synaptique. Ces vésicules libèrent des neurotransmetteurs quand ils fusionnent avec la membrane plasmique présynaptique (exocytose), et ils seront prêts pour un autre cycle de libération après avoir été régénéré à partir de la membrane plasmique (endocytose) et rechargé avec neurotransmetteur. La recherche sur la dynamique des mécanismes sous-jacents et le recyclage des vésicules synaptiques a été fortement accélérée par l'introduction de colorants styryles FM ^1. Ces molécules bipolaires, qui ont chargés positivement groupes de tête hydrophiles et queues hydrophobes (plusieurs colorants dans la figure 1A, stereoview de FM1-43 dans la figure 1B), peuvent réversible entrer et sortir de membranes lipidiques sans les imprégner. Groupes de colorants FM partagent des caractéristiques similaires qui influent sur la plage de la lumière qu'ils émettent. Par exemple, FM2-10, FM1-43, et FM1-84 ont une double liaison entre les deux composés cycliques et shoémission verte w. La différence entre eux est la longueur de la queue hydrophobe, qui détermine son hydrophobie et donc la vitesse de sortie de la membrane (décloisonnement). Dans les cas de FM5 et FM4-95-64, trois doubles liaisons relient les composés cycliques, et ils montrent émission dans le rouge. Ces colorants diffèrent en ce qui concerne leurs parties hydrophiles. Dans tous les colorants FM, l'intensité de fluorescence augmente quand ils sont insérés dans les membranes biologiques, en raison d'une augmentation du rendement quantique dans l'environnement hydrophobe par rapport à l'environnement hydrophile. Ainsi, les variations de l'intensité FM représentent les variations de la valeur de la membrane. Les différentes couleurs (spectres d'émission) et hydrophobicités font la FM teint un outil de recherche polyvalent dans le recyclage des vésicules synaptiques.

Sur la base de ces caractéristiques, les colorants FM sont principalement utilisés selon le schéma suivant dans l'analyse de recyclage des vésicules synaptiques (figure 2). Neurons sont baignées dans une solution extracellulaire contenant le colorant FM, ce qui lui permet d'être pris dans des vésicules synaptiques (SVS) car ils forment par endocytose (coloration). Le colorant est ensuite lavé par application d'une solution de colorant extracellulaire libre, ce qui révèle les terminaisons nerveuses fonctionnelles, c'est à dire que ceux subissant une endocytose activement contiendra un groupe de vésicules synaptiques qui sont chargés avec le colorant (figure 2 du bas). Exocytose ultérieur conduit à la perte du colorant FM à l'espace extracellulaire et une perte concomitante de la fluorescence (de décoloration; due à la fois à la décloisonnement à un environnement hydrophile et diffusion en dehors du site de l'exocytose). Par conséquent, les changements dans FM intensité de fluorescence sont des indicateurs de la vésicule synaptique exo-et endocytose.

Colorants FM ont été utilisés pour colorer et décolorer les vésicules synaptiques dans divers organismes et préparations ^2,3. Les exemples incluent neur mammifèrescultures onal ^4-9, des tranches de cerveau de mammifères ^{10,11, 12,13} jonctions neuromusculaires, les neurones bipolaires de la rétine ^14,15 et cellules ciliées de la cochlée ^16.

En général, dans ces expériences, les colorations et décoloration sont déclenchées par la stimulation largement les neurones (activité évoquée). Récemment, cependant, de la vésicule synaptique recyclage en réponse à la stimulation faible a également été analysée, de même que le recyclage en l'absence d'un stimulus externe (de l'activité synaptique spontanée et miniature) ^9,17-19. Activités synaptiques spontanés et miniatures sont définis comme ceux qui se produisent en l'absence de stimuli externes, avec l'ancien impliquant la décharge spontanée de potentiels d'action (figure 3). Ces activités synaptiques faibles sont associés à de faibles changements de signaux FM que celles déclenchées par une vaste stimulation. La mesure exige que les changements dans Déess FMintensité rence reflètent fidèlement l'exocytose des vésicules synaptiques ou endocytose mais les changements ne artéfactuelles en intensité. L'une des causes de l'artefact est la présence d'une coloration non spécifique de la membrane de plasma par des colorants FM. Lavage progressif de cette composante va conduire à un changement progressif dans l'intensité de fluorescence mesurée, qui sera attribué à tort à des activités synaptiques. Ce facteur peut être réduite par des méthodes appropriées (voir Protocole). La cause la plus notable de l'artefact est le photoblanchiment de colorant FM retenu dans les vésicules synaptiques. Les changements liés à l'intensité photoblanchiment-FM doivent être petites par rapport aux biologiques (synaptiques) les changements qui sont évalués. Le développement récent des appareils sensibles, par exemple la caméra dispositif à couplage de charge d'électrons multipliant (EMCCD), permet de réduire photoblanchiment en raccourcissant la durée d'exposition et l'affaiblissement de l'intensité de la lumière utilisée pour exciter le fluorophore. Une autre cause de l'artefact est une dérive in le niveau de focalisation du microscope optique. La dérive de mise au point au cours d'une session de formation d'image peut être causée par des effets mécaniques ou thermiques, et à tort entraîner un changement dans l'intensité de fluorescence mesurée.

Nous décrivons ici des protocoles et des équipements qui font qu'il est possible d'utiliser des colorants FM pour analyser recyclage des vésicules synaptiques, même dans le contexte de faible ou pas de stimulation, en particulier, l'activité synaptique miniature. Nous montrons des exemples de la coloration et décoloration de vésicules synaptiques lors d'événements évoqué et spontanées, en utilisant les neurones de rongeurs hippocampe en culture, et l'imagerie de la phase de décoloration. Nous démontrons également comment évaluer le degré de photoblanchiment FM colorant, en l'absence de toute perte de colorant FM en raison des activités synaptiques.

Protocol

Une. Culture primaire de neurones du cerveau des mammifères Toutes les procédures animales réalisées dans cette étude sont approuvées par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université de l'Iowa. Préparer la culture de la cellule dissociée des régions CA3 de l'hippocampe-CA1 de souris ou des rats aux jours postnataux 0-1 19,20. Plaquer les cellules de l'hippocampe sur des lamelles de 12 mm d'épaiss…

Representative Results

A titre d'exemple, nous montrons des résultats représentatifs pour le cours du temps de décoloration des vésicules synaptiques (figure 4). Neurones hippocampiques en culture ont été colorées avec FM4-64, en utilisant l'activité synaptique spontanée (étape 2.3) et lavées avec une solution sans colorant (solution de rinçage 2). L'imagerie montre le cours initial de temps de décoloration utilisant activité spontanée (étape 5.3) (partie initiale de la ligne continue, la f…

Discussion

Nous avons décrit les protocoles de coloration et de décoloration des vésicules synaptiques en réponse à évoqué, l'activité synaptique spontanée et miniature, et pour l'imagerie au cours de la phase de décoloration. En plus des protocoles existants, nous avons inclus un nouveau protocole d'observer la décoloration FM sur la base de l'activité synaptique miniature. L'utilisation de ces protocoles, nous l'avons déjà identifié des anomalies dans les neurones en culture à partir d&#39…

Materials

Pulse generator	AMPI	Master-8
Isolated stimulator	Digitimer	DS3
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TS100	This is used for assessing the cell morphology at low magnification.
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TiE	This is used for high-resolution fluorescence and transmitted light imaging, with minimal focus drift.
Objective lens	Nikon		Water-immersion lens is recommended. Oil-immersion lens is usable unless an imaged structure is deep from the coverslip surface (e.g. >10 μm).
Filter cube	Nikon	77032509	490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em for FM1-43
Filter cube	Nikon	77032809	490/20-nm ex, 510-nm dclp, 650-nm-LP em for FM4-64.
EMCCD camera	Andor Technology	iXon EM+ DU-860	This EMCCD camera is used for high-sensitivity detection of fluorescence.
Liquid recirculating chiller	Solid State Cooling Systems	Oasis 160	This is used for continuously perfusing the camera with chilled water for maintaining a temperature of -80°C, and thereby reducing noise.
LED	CoolLED-Custom Interconnect	490 nm	This light source is used for rapid on/off control of fluorescence excitation.
Image acquisition software	Andor Technology	Solis
Imaging chamber	Warner Instruments	RC-21BRFS
Fast perfusion system	Warner Instruments	SF-77B
CNQX	Tocris Bioscience	1045
D,L-AP5	Tocris Bioscience	0106
Tetrodotoxin	Tocris Bioscience	1069	Caution: toxic reagent. Handle with care.
FM1-43	Invitrogen	T35356
Aldehyde-fixable FM1-43 (FM1-43FX)	Invitrogen	F35355
FM4-64	Invitrogen	T13320
Aldehyde-fixable FM4-64 (FM4-64FX)	Invitrogen	F34653
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I0634
Hanks’ balanced salt	Sigma-Aldrich	H2387
Minimum Essential Medium	Invitrogen	51200-038	This solution does not contain phenol red that will interfere with fluorescence imaging.
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Caution: toxic reagent. Handle with care.
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903