JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

בחינה של Synaptic שלפוחיות מחזור באמצעות צבעי FM במהלך עורר, ספונטני, ופעילויות Synaptic מיניאטורות

Published: March 31, 2014
doi:
10.3791/50557
, , , ,
1Department of Molecular Physiology & Biophysics,University of Iowa Carver College of Medicine, 2Department of Biology & Biochemistry,University of Bath

Summary

אנו מתארים את השימוש של צבעי FM styryl למחזור שלפוחית ​​הסינפטית תמונה בקצוות עצבים תפקודיים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם לא רק לעורר, אלא גם ספונטני ופעילות הסינפטית מיניאטורי. הפרוטוקול מרחיב את מגוון אירועים הסינפטי שניתן להעריך בצורה יעילה.

Abstract

שלפוחית ​​סינפטית בקצוות עצבים תפקודיים עוברת exocytosis ואנדוציטוזה. מחזור שלפוחית ​​הסינפטית זה יכול להיות יעיל ניתח באמצעות צבעי FM styryl, אשר חושפים את המחזור בממברנה. פרוטוקולים מקובלים לשימוש בצבעי FM נועדו לניתוח נוירונים הבאים פעילות הסינפטית מגורה (עורר). לאחרונה, פרוטוקולים הפכו זמינים לניתוח אותות FM המלווים את פעילות הסינפטית חלשה יותר, כגון אירועים הסינפטי ספונטניים או מיניאטורי. ניתוח של שינויים הקטנים אלה באותות FM דורש כי מערכת ההדמיה היא רגישה מספיק כדי לזהות שינויים קטנים בעוצמתם, אך כי שינויי artifactual של משרעת גדולה מודחקים. כאן אנו מתארים פרוטוקול שניתן להחיל על עורר, ספונטני, ופעילות הסינפטית מיניאטורי, ולהשתמש בנוירונים בהיפוקמפוס בתרבית לדוגמה ירושלים. פרוטוקול זה משלב גם אמצעי להערכת שיעור photobleaching של צבעי FM, כמו זה הוא משמעותימקור לחפצים כאשר הדמיה שינויים קטנים בעוצמתן.

Introduction

הפונקציונליות של שלפוחית ​​סינפטית היא הקובע חשוב של שידור סינפטי. בועיות אלו לשחרר נוירוטרנסמיטרים כאשר הם מתמזגים עם קרום presynaptic הפלזמה (exocytosis), והם הופכים להיות מוכנים למחזור נוסף של שחרור לאחר שנוצר מחדש מקרום הפלזמה (אנדוציטוזה) ומחדש עם מוליך עצבי. חקר הדינמיקה של ומנגנוני מחזור שלפוחית ​​הסינפטית כבר מואץ באופן משמעותי על ידי ההקדמה של צבעי FM styryl 1. מולקולות אלה amphipathic, אשר באופן חיובי יש לחייב קבוצות ראש הידרופילי וזנב הידרופובי (צבעים מרובים באיור 1 א ', stereoview של FM1-43 באיור 1 ב'), יכולות להיכנס ולצאת הפיך ממברנות שומנים בדם ללא מחלחל אותם. קבוצות של צבעי FM חולקים תכונות דומות המשפיעות על הטווח של אור שהם פולטים. לדוגמא, FM2-10, יש לי FM1-43, וFM1-84 קשר כפול אחד בין שתי תרכובות וsho מחזורייםפליטה ירוקה w. ההבדל ביניהם הוא אורך הזנב הידרופובי, הקובע הידרופוביות שלה, ולכן השיעור של יציאה מהקרום (departitioning). במקרים של FM5 -95 וFM4-64, שלושה קשרים כפולים לקשר תרכובות מחזוריות, והם מראים פליטה אדומה. צבעים אלו שונים ביחס לחלקים הידרופילי שלהם. בכל צבעי FM, עוצמת הקרינה עולה כאשר הם מוכנסים לתוך ממברנות ביולוגיות, כתוצאה מגידול בתשואת קוונטים בהידרופובי הסביבה ביחס לסביבה הידרופילי. לפיכך השינויים בעוצמת FM מייצגים את השינויים במחזור הממברנה. צבעים השונים (ספקטרום פליטה) וhydrophobicities להפוך FM צובע כלי מחקר מגוונים במחזור שלפוחית ​​הסינפטית.

בהתבסס על תכונות אלה, צבעי FM משמשים בעיקר על פי התכנית הבאה בעת ניתוח מחזור שלפוחית ​​הסינפטית (איור 2). עצבוןשל שטופים בפתרון תאי המכיל את צבע FM, המאפשר לה לנקוט לתוך שלפוחית ​​סינפטית (SVS) כפי שהם יוצרים באמצעות אנדוציטוזה (מכתים). לצבוע לאחר מכן נשטף החוצה על ידי יישום פתרון תאי נטול צבע, זה חושף את הקצוות עצבים תפקודיים, כלומר רק את אנדוציטוזה באופן פעיל בתהליך תכיל מקבץ של שלפוחית ​​סינפטית שנטענים עם הצבע (איור 2 תחתון). exocytosis לאחר מוביל לאובדן של צבע FM למרחב תאי ואובדן נלווה של הקרינה (destaining; בשל שני departitioning לסביבה הידרופילי ודיפוזיה מהאתר של exocytosis). לכן השינויים בעוצמת הקרינה FM הם אינדיקטורים של שלפוחית ​​Exo-ואנדוציטוזה הסינפטי.

צבעי FM שימשו כדי להכתים וdestain שלפוחית ​​סינפטית באורגניזמים והכנות 2,3 שונים. דוגמאות כוללות neur היונקיםתרבויות onal 4-9, פרוסות של יונקים מוח 10,11, צמתים התוקפת 12,13, הנוירונים דו קוטביים רשתית 14,15, ותאי שיער של שבלול אוזן 16.

בדרך כלל בניסויים כאלה, גם הצביעה וdestaining מופעלים על ידי הרחבת המרצת הנוירונים (הפעילות עורר). לאחרונה, עם זאת, מחזור שלפוחית ​​הסינפטית בתגובה לגירוי חלש יש גם ניתח, כפי שיש במחזור, בהעדר גירוי חיצוני (פעילות הסינפטית ספונטנית ומיניאטורי) 9,17-19. פעילות הסינפטית ספונטנית וזעירה מוגדרות אלה המתרחשים בהיעדר גירויים חיצוניים, עם לשעבר מעורב הירי הספונטני של פוטנציאלי פעולה (איור 3). פעילות הסינפטית החלשה אלה קשורים לשינויים קטנים יותר באותות FM מאלה שמופעלים על ידי גירוי נרחב. המדידה דורשת שהשינויים בfluoresc FMעוצמת ence משקפת במדויק exocytosis הסינפטי שלפוחית ​​או אנדוציטוזה אך שינויים לא artifactual באינטנסיביות. אחת סיבות לחפץ היא נוכחותם של כתמים ספציפיים של קרום הפלזמה על ידי צבעי FM. סחף הדרגתי של רכיב זה יביא לשינוי הדרגתי בעוצמת הקרינה שנמדדה, שיהיה מיוחס בטעות לפעילות הסינפטית. גורם זה יכול להיות מופחת על ידי שיטות מתאימות (ראה פרוטוקול). הסיבה הבולטת ביותר של החפץ היא photobleaching של צבע FM נשמרים בתוך שלפוחית ​​סינפטית. השינויים הקשורים לphotobleaching בעוצמת FM חייבים להיות קטנים בהשוואה לשינויים הביולוגיים (הסינפטי) שנמדדו. הפיתוח האחרון של מצלמות רגישות, למשל המצלמה מכשיר תשלום מצמידים אלקטרונים הכפלה (EMCCD), מאפשר למזער photobleaching על ידי קיצור זמן חשיפה ומחליש את עוצמת האור המשמש כדי לעורר את fluorophore. סיבה נוספת לחפץ היא i להיסחףn את רמת ההתמקדות של מיקרוסקופ אור. להיסחף להתמקד במהלך פגישת הדמיה יכולה להיגרם על ידי השפעות מכאניות או תרמית, ותהיה בטעות יביא לשינוי בעוצמת הקרינה שנמדדה.

כאן אנו מתארים פרוטוקולים וציוד המאפשרים להשתמש בצבעי FM לנתח מחזור שלפוחית ​​הסינפטית אפילו בהקשר של גירוי חלש או לא, בפרט, הפעילות הסינפטית מיניאטורי. אנחנו מראים דוגמאות לצביעה וdestaining של שלפוחית ​​במהלך אירועים הסינפטי עוררים וספונטניים, תוך שימוש בתאי עצב בהיפוקמפוס המכרסם בתרבית, והדמית שלב destaining. אנחנו גם מדגימים כיצד להעריך את מידת photobleaching צבע FM, בהעדר כל אובדן צבע FM בשל פעילות הסינפטית.

Protocol

1. תרבות העיקרית של נוירונים מהמוח של היונקים נהלי כל החיה שבוצעו במחקר זה אושר על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת איווה. הכן תרבית תאים הניתקת של אזורי CA3-CA1…

Representative Results

כדוגמא, אנו מציגים תוצאות נציג לקורס זמן destaining של שלפוחית ​​סינפטית (איור 4). נוירונים בהיפוקמפוס בתרבית הוכתמו FM4-64 באמצעות הפעילות הספונטנית סינפטיים (שלב 2.3) ונשטפו עם פתרון נטול צבע (שטיפת פתרון 2). ההדמיה מציגה את מהלך זמן destaining הראשוני באמצעות פעילות ספו?…

Discussion

יש לנו תארנו פרוטוקולים להכתמה וdestaining שלפוחית ​​סינפטית בתגובה לעורר, פעילות הסינפטית ספונטנית וזעירה, והדמיה בשלב destaining. בנוסף לפרוטוקולים הקיימים, יש לנו כלל בפרוטוקול חדש של התבוננות destaining FM המבוסס על פעילות הסינפטית מיניאטורי. תוך שימוש בפרוטוקולים אלה, זיהינ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מודים לחברים במעבדה Harata לדיונים מועילים לאורך כל ביצוע עבודה זו. עבודה זו מומנה על ידי מענקים מאיגוד הלב האמריקאי, קרן דיסטוניה המחקר רפואי, Mallinckrodt אדוארד, הבן הקרן, הקרן הלאומית למדע והקרן וייטהול לNCH

Materials

Pulse generator AMPI Master-8
Isolated stimulator Digitimer DS3
Inverted microscope Nikon Eclipse TS100 This is used for assessing the cell morphology at low magnification.
Inverted microscope Nikon Eclipse TiE This is used for high-resolution fluorescence and transmitted light imaging, with minimal focus drift.
Objective lens Nikon Water-immersion lens is recommended. Oil-immersion lens is usable unless an imaged structure is deep from the coverslip surface (e.g. >10 μm).
Filter cube Nikon 77032509 490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em for FM1-43
Filter cube Nikon 77032809 490/20-nm ex, 510-nm dclp, 650-nm-LP em for FM4-64. 
EMCCD camera Andor Technology iXon EM+ DU-860 This EMCCD camera is used for high-sensitivity detection of fluorescence.
Liquid recirculating chiller Solid State Cooling Systems Oasis 160 This is used for continuously perfusing the camera with chilled water for maintaining a temperature of -80°C, and thereby reducing noise.
LED CoolLED-Custom Interconnect 490 nm  This light source is used for rapid on/off control of fluorescence excitation.
Image acquisition software Andor Technology Solis
Imaging chamber Warner Instruments RC-21BRFS
Fast perfusion system Warner Instruments SF-77B
CNQX Tocris Bioscience 1045
D,L-AP5 Tocris Bioscience 0106
Tetrodotoxin Tocris Bioscience 1069 Caution: toxic reagent. Handle with care.
FM1-43 Invitrogen T35356
Aldehyde-fixable FM1-43 (FM1-43FX) Invitrogen F35355
FM4-64 Invitrogen T13320
Aldehyde-fixable FM4-64 (FM4-64FX) Invitrogen F34653
Ionomycin Sigma-Aldrich I0634
Hanks’ balanced salt Sigma-Aldrich H2387
Minimum Essential Medium Invitrogen 51200-038 This solution does not contain phenol red that will interfere with fluorescence imaging.
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Caution: toxic reagent. Handle with care.
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
  2. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nat. Protoc. 1, 2916-2921 (2006).
  3. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. . Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes. , 77-83 (2012).
  4. Newton, J., Murthy, V. Measuring exocytosis in neurons using FM labeling. J. Vis. Exp. , (2006).
  5. Evans, G. J., Cousin, M. A. Simultaneous monitoring of three key neuronal functions in primary neuronal cultures. J. Neurosci. Methods. 160, 197-205 (2007).
  6. Cousin, M. A. Use of FM1-43 and other derivatives to investigate neuronal function. Curr. Protoc. Neurosci. 2, (2008).
  7. Clayton, E. L., Cousin, M. A. Quantitative monitoring of activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicle membrane by fluorescent dextran imaging. J. Neurosci. Methods. 185, 76-81 (2009).
  8. Cheung, G., Cousin, M. A. Quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using FM dyes. J. Vis. Exp. , (2011).
  9. Welzel, O., Tischbirek, C. H., Kornhuber, J., Groemer, T. W. Pool-independent labelling of synaptic vesicle exocytosis with single vesicle resolution in rat hippocampal neurons. J. Neurosci. Methods. 205, 258-264 (2012).
  10. Winterer, J., Stanton, P. K., Muller, W. Direct monitoring of vesicular release and uptake in brain slices by multiphoton excitation of the styryl FM 1-43. Biotechniques. 40, 343-351 (2006).
  11. Kay, A. R. Imaging FM dyes in brain slices. Cold Spring Harb. Protoc. , (2007).
  12. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods Mol. Biol. 440, 349-369 (2008).
  13. Amaral, E., Guatimosim, S., Guatimosim, C. Using the fluorescent styryl dye FM1-43 to visualize synaptic vesicles exocytosis and endocytosis in motor nerve terminals. Methods Mol. Biol. 689, 137-148 (2011).
  14. Guatimosim, C., von Gersdorff, H. Optical monitoring of synaptic vesicle trafficking in ribbon synapses. Neurochem. Int. 41, 307-312 (2002).
  15. Joselevitch, C., Zenisek, D. Imaging exocytosis in retinal bipolar cells with TIRF microscopy. J. Vis. Exp. , 1305 (2009).
  16. Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22, 3939-3952 (2002).
  17. Sara, Y., Virmani, T., Deak, F., Liu, X. An isolated pool of vesicles recycles at rest and drives spontaneous neurotransmission. Neuron. 45, 563-573 (2005).
  18. Wilhelm, B. G., Groemer, T. W., Rizzoli, S. O. The same synaptic vesicles drive active and spontaneous release. Nat. Neurosci. 13, 1454-1456 (2010).
  19. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Miniature release events of glutamate from hippocampal neurons are influenced by the dystonia-associated protein torsinA. Synapse. 66, 807-822 (2012).
  20. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Ho, K. W., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Synaptic vesicle recycling is enhanced by torsinA that harbors the DYT1 dystonia mutation. Synapse. 66, 453-464 (2012).
  21. Kavalali, E. T., Klingauf, J., Tsien, R. W. Activity-dependent regulation of synaptic clustering in a hippocampal culture system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 12893-12900 (1999).
  22. Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
  23. Nosyreva, E., Kavalali, E. T. Activity-dependent augmentation of spontaneous neurotransmission during endoplasmic reticulum stress. J. Neurosci. 30, 7358-7368 (2010).
  24. Ryan, T. A., Smith, S. J. Vesicle pool mobilization during action potential firing at hippocampal synapses. Neuron. 14, 983-989 (1995).
  25. Ryan, T. A., Smith, S. J., Reuter, H. The timing of synaptic vesicle endocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 5567-5571 (1996).
  26. Harata, N., et al. Limited numbers of recycling vesicles in small CNS nerve terminals: implications for neural signaling and vesicular cycling. Trends Neurosci. 24, 637-643 (2001).
  27. Klingauf, J., Kavalali, E. T., Tsien, R. W. Kinetics and regulation of fast endocytosis at hippocampal synapses. Nature. 394, 581-585 (1998).
  28. Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J. Cell Biol. 168, 929-939 (2005).
  29. Kay, A. R., et al. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat. Neuron. 24, 809-817 (1999).
  30. Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. An ultrastructural readout of fluorescence recovery after photobleaching using correlative light and electron. 1, 988-994 (2006).
  31. Moulder, K. L., Jiang, X., Taylor, A. A., Benz, A. M., Mennerick, S. Presynaptically silent synapses studied with light microscopy. J. Vis. Exp. , (2010).
  32. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of synaptic activity in hippocampal slices with FM1-43 enabled by fluorescence quenching. Neuron. 24, 803-808 (1999).
  33. Harata, N. C., Choi, S., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Frequency-dependent kinetics and prevalence of kiss-and-run and reuse at hippocampal synapses studied with novel quenching methods. Neuron. 49, 243-256 (2006).
  34. Piedras-Renteria, E. S., et al. Presynaptic homeostasis at CNS nerve terminals compensates for lack of a key Ca2+ entry pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 3609-3614 (2004).
  35. Rosenmund, C., Stevens, C. F. Definition of the readily releasable pool of vesicles at hippocampal synapses. Neuron. 16, 1197-1207 (1996).
  36. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Piedras-Renteria, E. S., Tsien, R. W. Rapid reuse of readily releasable pool vesicles at hippocampal synapses. Neuron. 28, 221-231 (2000).
  37. Kawano, H., et al. Long-term culture of astrocytes attenuates the readily releasable pool of synaptic vesicles. PLoS ONE. 8, (2012).
  38. Harata, N., Katayama, J., Takeshita, Y., Murai, Y., Akaike, N. Two components of metabotropic glutamate responses in acutely dissociated CA3 pyramidal neurons of the rat. Brain Res. 711, 223-233 (1996).
  39. Kira, T., Harata, N., Sakata, T., Akaike, N. Kinetics of sevoflurane action on GABA- and glycine-induced currents in acutely dissociated rat hippocampal neurons. Neuroscience. 85, 383-394 (1998).
  40. Harata, N., Katayama, J., Akaike, N. Excitatory amino acid responses in relay neurons of the rat lateral geniculate nucleus. Neuroscience. 89, 109-125 (1999).
  41. Albeanu, D. F., Soucy, E., Sato, T. F., Meister, M., Murthy, V. N. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS ONE. 3, e2146 (2008).
  42. Neves, G., Lagnado, L. The kinetics of exocytosis and endocytosis in the synaptic terminal of goldfish retinal bipolar cells. J. Physiol. 515, 181-202 (1999).
  43. Mazzone, S. B., et al. Fluorescent styryl dyes FM1-43 and FM2-10 are muscarinic receptor antagonists: intravital visualization of receptor occupancy. J. Physiol. 575, 23-35 (2006).
  44. Gale, J. E., Marcotti, W., Kennedy, H. J., Kros, C. J., Richardson, G. P. FM1-43 dye behaves as a permeant blocker of the hair-cell mechanotransducer channel. J. Neurosci. 21, 7013-7025 (2001).
  45. Li, D., Herault, K., Oheim, M., Ropert, N. FM dyes enter via a store-operated calcium channel and modify calcium signaling of cultured astrocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21960-21965 (2009).
  46. Crumling, M. A., et al. P2X antagonists inhibit styryl dye entry into hair cells. Neuroscience. 161, 1144-1153 (2009).
  47. Zhu, Y., Stevens, C. F. Probing synaptic vesicle fusion by altering mechanical properties of the neuronal surface membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 18018-18022 (2008).
  48. Thiagarajan, T. C., Lindskog, M., Tsien, R. W. Adaptation to synaptic inactivity in hippocampal neurons. Neuron. 47, 725-737 (2005).
  49. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
  50. Li, H., et al. Concurrent imaging of synaptic vesicle recycling and calcium dynamics. Front. Mol. Neurosci. 4, 34 (2011).
  51. Raingo, J., et al. VAMP4 directs synaptic vesicles to a pool that selectively maintains asynchronous neurotransmission. Nat. Neurosci. 15, 738-745 (2012).
  52. Martens, H., et al. Unique luminal localization of VGAT-C terminus allows for selective labeling of active cortical GABAergic synapses. J. Neurosci. 28, 13125-13131 (2008).
  53. Hua, Y., Sinha, R., Martineau, M., Kahms, M., Klingauf, J. A common origin of synaptic vesicles undergoing evoked and spontaneous fusion. Nat. Neurosci. 13, 1451-1453 (2010).
  54. Hua, Y., et al. A readily retrievable pool of synaptic vesicles. Nat. Neurosci. 14, 833-839 (2011).
  55. Groemer, T. W., Klingauf, J. Synaptic vesicles recycling spontaneously and during activity belong to the same vesicle. 10, 145-147 (2007).
  56. Moulder, K. L., et al. A specific role for Ca2+-dependent adenylyl cyclases in recovery from adaptive presynaptic silencing. J. Neurosci. 28, 5159-5168 (2008).
  57. Crawford, D. C., Jiang, X., Taylor, A., Moulder, K. L., Mennerick, S. Differential requirement for protein synthesis in presynaptic unmuting and muting in hippocampal glutamate terminals. PLoS ONE. 7, (2012).
  58. Henkel, A. W., Lubke, J., Betz, W. J. FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 1918-1923 (1996).
  59. Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM 1- 43 photoconversion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 12748-12753 (2001).
  60. Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying synaptic vesicle pools using photoconversion of styryl dyes. J. Vis. Exp. , (2010).
  61. Schikorski, T. Monitoring rapid endocytosis in the electron microscope via photoconversion of vesicles fluorescently labeled with FM1-43. Methods Mol. Biol. 657, 329-346 (2010).
  62. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. FM dye photoconversion for visualizing synaptic vesicles by electron microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2012, 84-86 (2012).
  63. Schote, U., Seelig, J. Interaction of the neuronal marker dye FM1-43 with lipid membranes. Thermodynamics and lipid ordering. Biochim. Biophys. Acta. 1415, 135-146 (1998).
  64. Harata, N. C., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Kiss-and-run and full-collapse fusion as modes of exo-endocytosis in neurosecretion. J. Neurochem. 97, 1546-1570 (2006).

Tags

Synaptic Vesicle RecyclingFM DyesEvoked Synaptic ActivitySpontaneous Synaptic ActivityMiniature Synaptic ActivityMembrane TurnoverHippocampal NeuronsPhotobleaching
check_url/50557?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities. J. Vis. Exp. (85), e50557, doi:10.3791/50557 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image