Exame do Synaptic Vesicle Reciclagem Usando FM Corantes Durante Evocado, espontânea, e as atividades de Synaptic miniatura

Summary

Descreve-se o uso de corantes estiril FM imagem sináptica reciclagem vesícula nos terminais nervosos funcionais. Este protocolo pode ser aplicado não só a evocada, mas também espontânea e actividades sinápticas em miniatura. O protocolo expande a variedade de eventos sinápticos que podem ser eficazmente analisados.

Abstract

Vesículas sinápticas em terminações nervosas funcionais sofrem exocitose e endocitose. Esta reciclagem das vesículas sinápticas pode ser efetivamente analisados ​​usando corantes estiril FM, que revelam turnover da membrana. Protocolos convencionais para o uso de corantes FM foram concebidos para a análise de neurônios seguinte estimulada (evocado) atividade sináptica. Recentemente, protocolos tornaram-se disponíveis para a análise dos sinais de FM que acompanham as atividades sinápticas mais fracos, como eventos sinápticas espontâneas ou em miniatura. A análise destas pequenas alterações nos sinais de FM requer que o sistema de imagem é suficientemente sensível para detectar pequenas alterações na intensidade, ainda que as mudanças de artefatuais de grande amplitude são suprimidas. Aqui, descrevemos um protocolo que pode ser aplicado a evocado, espontânea, e actividades sinápticas em miniatura, e usar os neurónios do hipocampo em cultura como um exemplo. Este protocolo inclui também um meio de avaliar a taxa de fotobranqueamento de corantes FM, como este é um significativofonte de artefactos quando imagens pequenas alterações em intensidade.

Introduction

A funcionalidade das vesículas sinápticas é um importante determinante da transmissão sináptica. Essas vesículas libertar neurotransmissores quando se fundem com a membrana plasmática pré-sináptica (exocitose), e tornam-se pronto para um outro ciclo de libertação depois de ser regenerada a partir da membrana plasmática (endocitose) e recarregado com neurotransmissor. A investigação sobre a dinâmica dos mecanismos subjacentes e reciclagem das vesículas sinápticas foi muito acelerado pela introdução de corantes estiril FM ^1. Estas moléculas anfipáticas, que têm carga positiva grupos de cabeça hidrófilos e caudas hidrofóbicas (vários corantes na Figura 1A, stereoview de FM1-43 na figura 1B), de forma reversível pode entrar e sair de membranas lipídicas sem impregnar a. Grupos de corantes FM compartilham características semelhantes que influenciam a gama de luz que eles emitem. Por exemplo, FM2-10, FM1-43, e FM1-84 tem uma dupla ligação entre os dois compostos cíclicos e shoemissão verde w. A diferença entre eles é o comprimento da cauda hidrofóbica, que determina a sua hidrofobicidade e, por conseguinte, a taxa de saída da membrana (departitioning). Nos casos de FM5-95 e FM4-64, três ligações duplas ligação dos compostos cíclicos, e que mostram emissão vermelha. Estes corantes são diferentes no que diz respeito às suas partes hidrofílicas. Em todos os corantes de FM, a intensidade da fluorescência aumenta quando eles são inseridos em membranas biológicas, devido a um aumento no rendimento quântico do ambiente hidrófobo em relação ao ambiente hidrofílico. Assim, as alterações na intensidade de FM representam as alterações no volume de membrana. As diferentes cores (espectros de emissão) e hidrofobicidades fazer a FM tinge uma ferramenta de pesquisa versátil na reciclagem de vesículas sinápticas.

Com base nestas características, os corantes FM são principalmente utilizados de acordo com o seguinte esquema, quando analisando reciclagem das vesículas sinápticas (Figura 2). Neurons são banhadas em uma solução extracelular contendo o corante FM, permitindo que ele seja levado para vesículas sinápticas (SVS), que fazem através de endocitose (coloração). O corante é então lavado por aplicação de uma solução extracelular livre de corante, isto revela as terminações nervosas funcionais, isto é, apenas aqueles submetidos a endocitose activamente, devem conter um conjunto de vesículas sinápticas que são carregados com o corante (Figura 2 abaixo). Exocitose subsequente conduz à perda do corante FM para o espaço extracelular e uma perda concomitante de fluorescência (descoloração, devido a tanto o departitioning para um ambiente hidrofílico e difusão para longe do local de exocitose). Por conseguinte, as alterações na intensidade de fluorescência de FM são indicadores de vesícula sináptica exo e endocitose.

Corantes FM foram utilizados para corar e Destain as vesículas sinápticas em vários organismos e preparações ^2,3. Exemplos incluem neur mamíferosculturas onal ^4-9, fatias de cérebro de mamíferos ^10,11, junções neuromusculares ^12,13, neurônios bipolares da retina ^14,15, e as células ciliadas da cóclea ^16.

Normalmente em tais experiências, tanto coloração e descoloração são acionados por extensivamente estimular os neurônios (atividade evocada). Recentemente, no entanto, a reciclagem de vesícula sináptica em resposta à estimulação fraco foi também analisado, como tem de reciclagem, na ausência de um estímulo externo (actividade sináptica e espontânea diminuta) ^9,17-19. Atividades sinápticas espontâneas e miniatura são definidos como aqueles que ocorrem na ausência de estímulos externos, com o primeiro envolvendo a queima espontânea de potenciais de ação (Figura 3). Essas atividades sinápticas fracas estão associados a mudanças menores em sinais de FM que aquelas desencadeadas por estimulação extensa. A medição requer que as alterações na fluores FMintensidade cia refletir com precisão a exocitose das vesículas sinápticas ou endocitose mas as alterações não de artefatos em intensidade. Uma causa do artefacto é a presença de coloração não específica da membrana plasmática por corantes FM. Washout gradual deste componente vai conduzir a uma mudança gradual na intensidade da fluorescência medida, que serão erroneamente atribuído às actividades sinápticas. Este factor pode ser reduzido por métodos adequados (ver protocolo). A causa mais notável do artefato é a fotodegradação de corante FM retida dentro vesículas sinápticas. As mudanças relacionadas à fotodegradação na intensidade FM deve ser pequeno em comparação com os biológicos (sinápticas) mudanças que são medidos. O recente desenvolvimento de câmaras sensíveis, por exemplo, a câmara do dispositivo de carga acoplada multiplicação de electrões (EMCCD), faz com que seja possível, para minimizar a fotodegradação, encurtando o tempo de exposição e enfraquecimento da intensidade da luz usada para excitar o fluoróforo. Outra causa do artefato é um i derivan o nível de concentração da microscopia de luz. O desvio do foco, durante uma sessão de imagem pode ser causada por efeitos mecânicos ou térmicos, e erroneamente conduzir a uma mudança na intensidade de fluorescência medido.

Aqui descrevemos protocolos e equipamentos que tornam possível a utilização de corantes FM para analisar a reciclagem de vesículas sinápticas, mesmo no contexto de uma fraca ou nenhuma estimulação, em particular, a actividade sináptica em miniatura. Mostramos exemplos de coloração e descoloração de vesículas sinápticas evocadas durante os eventos e espontânea, utilizando culturas de neurônios do hipocampo de roedores, e imaginando a fase de descoloração. Também demonstramos como avaliar o grau de FM corante fotodegradação, na ausência de qualquer perda corante FM devido às atividades sinápticas.

Protocol

1. Cultura primária de neurônios do cérebro dos mamíferos Todos os procedimentos com animais realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê da Universidade de Iowa Institutional Animal Care e Use. Prepare a cultura de células dissociadas de regiões CA3-CA1 do hipocampo de ratos ou ratazanas, nos dias pós-natal 0-1 19,20. Placa as células do hipocampo em lamelas de 12 mm de espessura (número 0) pré-carregados com a camada alimentadora de células gliais d…

Representative Results

Como um exemplo, mostramos resultados representativos para o curso de tempo da descoloração das vesículas sinápticas (Figura 4). Neurónios do hipocampo em cultura foram coradas com FM4-64 utilizando a actividade sináptica espontânea (passo 2.3) e lavou-se com solução livre de corante (solução 2 enxaguamento). A imagem mostra o curso inicial de tempo de descoloração usando atividade espontânea (passo 5.3) (parte inicial da linha contínua, a Figura 4A). Isto é seguido por …

Discussion

Descrevemos os protocolos de coloração e descoloração vesículas sinápticas em resposta a evocada, atividade sináptica espontânea e miniatura, e para geração de imagens durante a fase de descoloração. Em adição aos protocolos existentes, que têm incluído um novo protocolo de observar a descoloração FM com base na actividade sináptica em miniatura. Usando estes protocolos, que anteriormente identificado anormalidades nos neurônios cultivados a partir de um modelo do rato da distonia distúrbio de movim…

Materials

Pulse generator	AMPI	Master-8
Isolated stimulator	Digitimer	DS3
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TS100	This is used for assessing the cell morphology at low magnification.
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TiE	This is used for high-resolution fluorescence and transmitted light imaging, with minimal focus drift.
Objective lens	Nikon		Water-immersion lens is recommended. Oil-immersion lens is usable unless an imaged structure is deep from the coverslip surface (e.g. >10 μm).
Filter cube	Nikon	77032509	490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em for FM1-43
Filter cube	Nikon	77032809	490/20-nm ex, 510-nm dclp, 650-nm-LP em for FM4-64.
EMCCD camera	Andor Technology	iXon EM+ DU-860	This EMCCD camera is used for high-sensitivity detection of fluorescence.
Liquid recirculating chiller	Solid State Cooling Systems	Oasis 160	This is used for continuously perfusing the camera with chilled water for maintaining a temperature of -80°C, and thereby reducing noise.
LED	CoolLED-Custom Interconnect	490 nm	This light source is used for rapid on/off control of fluorescence excitation.
Image acquisition software	Andor Technology	Solis
Imaging chamber	Warner Instruments	RC-21BRFS
Fast perfusion system	Warner Instruments	SF-77B
CNQX	Tocris Bioscience	1045
D,L-AP5	Tocris Bioscience	0106
Tetrodotoxin	Tocris Bioscience	1069	Caution: toxic reagent. Handle with care.
FM1-43	Invitrogen	T35356
Aldehyde-fixable FM1-43 (FM1-43FX)	Invitrogen	F35355
FM4-64	Invitrogen	T13320
Aldehyde-fixable FM4-64 (FM4-64FX)	Invitrogen	F34653
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I0634
Hanks’ balanced salt	Sigma-Aldrich	H2387
Minimum Essential Medium	Invitrogen	51200-038	This solution does not contain phenol red that will interfere with fluorescence imaging.
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Caution: toxic reagent. Handle with care.
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903