JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Onderzoek van de synaptische vesikel Recycling FM Kleurstoffen Tijdens Evoked, Spontaan, en Miniature Synaptic Activiteiten

Published: March 31, 2014
doi:
10.3791/50557
, , , ,
1Department of Molecular Physiology & Biophysics,University of Iowa Carver College of Medicine, 2Department of Biology & Biochemistry,University of Bath

Summary

We beschrijven het gebruik van styrylkleurstoffen FM kleurstoffen aan het synaptische blaasje recycling in functionele zenuwuiteinden. Dit protocol kan niet alleen opgeroepen, maar ook spontane en miniatuur synaptische activiteiten worden toegepast. Het protocol breidt het aantal synaptische gebeurtenissen die effectief kan worden geëvalueerd.

Abstract

Synaptische blaasjes in functionele zenuwuiteinden ondergaan exocytose en endocytose. Deze synaptische vesikel recycling effectief kan worden geanalyseerd met behulp FM styryl kleurstoffen, die membraan omzet onthullen. Gebruikelijke protocollen voor het gebruik van FM kleurstoffen zijn ontworpen voor het analyseren neuronen na gestimuleerde (opgeroepen) synaptische activiteit. Onlangs zijn protocollen beschikbaar voor het analyseren van de FM-signalen die zwakker synaptische activiteiten, zoals spontane of miniatuur synaptische gebeurtenissen gevoegd worden. Analyse van deze kleine veranderingen FM signalen vereist dat het beeldvormingssysteem is voldoende gevoelig voor kleine veranderingen in intensiteit detecteren, maar dat kunstmatig veranderingen van grote amplitude worden onderdrukt. Hier beschrijven we een protocol dat kan worden toegepast opgeroepen, spontaan en miniatuur synaptische activiteiten en gebruik gekweekte hippocampale neuronen als voorbeeld. Dit protocol omvat ook een middel bepalen van de omvang van fotobleken FM kleurstoffen, aangezien dit een belangrijkebron van artefacten wanneer beeldvorming kleine veranderingen in de intensiteit.

Introduction

De functionaliteit van synaptische blaasjes is een belangrijke determinant van synaptische transmissie. Deze blaasjes vrijkomen neurotransmitters als ze fuseren met de presynaptische plasmamembraan (exocytose), en worden ze klaar voor een nieuwe cyclus van vrijlating na wordt geregenereerd uit het plasmamembraan (endocytose) en herladen met neurotransmitter. Onderzoek naar de dynamiek van en de onderliggende mechanismen van synaptische blaasje recycling is sterk versneld door de invoering van styrylkleurstoffen FM kleurstoffen 1. Deze amfipatische moleculen, die positief hebben geladen hydrofiele kopgroepen en hydrofobe staarten (meerdere kleurstoffen in figuur 1A, stereoview van FM1-43 in Figuur 1B), kunnen reversibel invoeren en lipide membranen verlaten zonder doordringt hen. Groepen van FM kleurstoffen onderlinge overeenkomsten vertonen dat het bereik van het licht dat ze uitstralen beïnvloeden. Bijvoorbeeld, FM2-10, FM1-43, en FM1-84 hebben een dubbele binding tussen twee cyclische verbindingen en show groene emissie. Het verschil tussen hen is de lengte van de hydrofobe staart, die haar hydrofobiciteit bepaalt en daarmee de snelheid van uitgang uit het membraan (departitioning). In het geval van FM5-95 en FM4-64, drie dubbele bindingen verbinden de cyclische verbindingen, en ze tonen rode emissie. Deze kleurstoffen verschillen met betrekking tot hun hydrofiele delen. In alle FM kleurstoffen, de fluorescentie-intensiteit toeneemt wanneer ze worden ingebracht in biologische membranen, door een toename in de quantum opbrengst in de hydrofobe omgeving ten opzichte van de hydrofiele omgeving. Dus de veranderingen in de FM-intensiteit geven de veranderingen in de membraan omzet. De verschillende kleuren (emissie spectra) en hydrofobiciteiten maken van de FM-kleurstoffen een veelzijdig onderzoeksinstrument in synaptische blaasje recycling.

Op basis van deze eigenschappen worden de FM kleurstoffen meestal gebruikt volgens het volgende schema bij het ​​analyseren synaptische vesikel recycling (figuur 2). Neurons baden in een extracellulaire oplossing die het FM kleurstof, waardoor het worden opgenomen in synaptische blaasjes (SV) aangezien zij via endocytose (kleuring). De kleurstof wordt vervolgens weggewassen door een kleurstof vrij extracellulaire oplossing, dit toont de functionele zenuwuiteinden, namelijk alleen die actief ondergaan endocytose wordt een cluster van synaptische blaasjes die worden geladen met de kleurstof (figuur 2 beneden) bevatten. Na exocytose leidt tot verlies van de FM kleurstof aan de extracellulaire ruimte en een gelijktijdige verlies van fluorescentie (ontkleuren, door zowel de departitioning een hydrofiel milieu en diffusie vanaf de plaats van exocytose). Daarom zijn de veranderingen in de FM-fluorescentie-intensiteit zijn indicatoren van synaptische blaasjes exo-en endocytose.

FM kleurstoffen zijn gebruikt om vlekken en Destain de synaptische blaasjes in verschillende organismen en preparaten 2,3. Voorbeelden zijn zoogdieren neuronale culturen 4-9, zoogdierbrein plakjes 10,11, neuromusculaire verbindingen 12,13, retinale bipolaire neuronen 14,15 en haarcellen van slakkenhuis 16.

Meestal in dergelijke experimenten, zowel kleuren en ontkleuren worden getriggerd door uitvoerig stimuleren van de neuronen (opgeroepen activiteit). Onlangs echter synaptische vesikel recycling reactie op zwakke stimulatie ook geanalyseerd, evenals recycling in afwezigheid van een externe stimulus (spontane en miniatuur synaptische activiteit) 9,17-19. Spontane en miniatuur synaptische activiteiten worden gedefinieerd als die die in afwezigheid van externe stimuli, met de voormalige waarbij spontane afvuren van actiepotentialen (figuur 3). Deze zwakke synaptische activiteiten geassocieerd met kleinere veranderingen FM signalen dan die veroorzaakt door uitgebreide stimulatie. De meting vereist dat de veranderingen in de FM-tllingen intensiteit nauwkeurig weergeven synaptische vesikel exocytose of endocytose maar niet artefactuele veranderingen in intensiteit. Een oorzaak van het artefact is de aanwezigheid van niet-specifieke kleuring van de plasmamembraan door FM kleurstoffen. Geleidelijke uitspoeling van deze component leidt tot een geleidelijke verandering in de gemeten fluorescentie-intensiteit die ten onrechte wordt toegeschreven aan synaptische activiteiten. Deze factor kan worden verminderd door geschikte methoden (zie Protocol). De meest opvallende oorzaak van het artefact is de photobleaching van FM kleurstof vastgehouden binnen synaptische blaasjes. De photobleaching gerelateerde veranderingen in FM intensiteit moet klein zijn in vergelijking met de biologische (synaptische) veranderingen die worden gemeten. De recente ontwikkeling van gevoelige camera's, zoals het elektronen vermenigvuldigen ladingsgekoppelde inrichting (EMCCD) camera maakt het mogelijk fotobleken door het verkorten belichtingstijd en verzwakking van de intensiteit van het licht gebruikt om de fluorofoor wekken minimaliseren. Een andere oorzaak van het artefact is een drift in de nadruk niveau van de lichtmicroscoop. De focus drift tijdens een opnamesessie kan worden veroorzaakt door mechanische of thermische effecten, en ten onrechte leiden tot een verandering in de gemeten fluorescentie-intensiteit.

Hier beschrijven we protocollen en apparatuur die het mogelijk maken FM kleurstoffen om synaptische vesikel recycling analyseren zelfs in het kader van zwakke of geen stimulatie met name de miniatuur synaptische activiteit. We tonen voorbeelden van de kleuren en ontkleuren van blaasjes tijdens opgewekte en spontane synaptische gebeurtenissen, met behulp van gekweekte knaagdier hippocampus neuronen, en beeldvorming van het ontkleuren fase. We tonen ook hoe de mate van FM kleurstof fotobleking evalueren, bij het ontbreken van een FM-kleurstof verlies als gevolg van synaptische activiteiten.

Protocol

1. Primaire Cultuur van neuronen van de hersenen van zoogdieren Alle dierlijke procedures uitgevoerd in deze studie worden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Iowa. Bereid de gedissocieerde celkweek van de CA3-CA1 regio van hippocampus van muizen of ratten op postnatale dagen 0-1 19,20. Plate hippocampale cellen op 12-mm dekglaasjes (dikte getal 0) preseeded de ratten gliale feeder-laag, in 24 putjes en met een dichthe…

Representative Results

Als voorbeeld tonen wij representatieve resultaten voor de ontkleuroplossing tijdsverloop van synaptische vesicles (figuur 4). Gekweekte hippocampale neuronen gekleurd met FM4-64 met de spontane synaptische activiteit (stap 2.3) en gewassen met kleurstofvrije oplossing (spoeloplossing 2). De beeldvorming toont de initiële ontkleuroplossing tijdsverloop behulp van spontane activiteit (stap 5.3) (eerste onderdeel van de continue lijn, figuur 4A). Dit wordt gevolgd door de ontkleuroplossi…

Discussion

We hebben protocollen beschreven voor het kleuren en ontkleuren synaptische blaasjes in reactie op opgewekte, spontane en miniatuur synaptische activiteit en voor het afbeelden in de ontkleuroplossing fase. Naast de bestaande protocollen, hebben we een nieuw protocol observeren de FM ontkleuroplossing basis van miniatuur synaptische activiteit inbegrepen. Met deze protocollen we eerder geïdentificeerde afwijkingen in gekweekte neuronen van een muismodel van de beweging dystonie. In vergelijking met hun tegenhangers in …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs danken de leden van de harata lab voor nuttige discussies tijdens de uitvoering van dit werk. Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de American Heart Association, de Dystonie Medical Research Foundation, de Edward Mallinckrodt, Jr Foundation, de National Science Foundation, en de Whitehall Stichting NCH

Materials

Pulse generator AMPI Master-8
Isolated stimulator Digitimer DS3
Inverted microscope Nikon Eclipse TS100 This is used for assessing the cell morphology at low magnification.
Inverted microscope Nikon Eclipse TiE This is used for high-resolution fluorescence and transmitted light imaging, with minimal focus drift.
Objective lens Nikon Water-immersion lens is recommended. Oil-immersion lens is usable unless an imaged structure is deep from the coverslip surface (e.g. >10 μm).
Filter cube Nikon 77032509 490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em for FM1-43
Filter cube Nikon 77032809 490/20-nm ex, 510-nm dclp, 650-nm-LP em for FM4-64. 
EMCCD camera Andor Technology iXon EM+ DU-860 This EMCCD camera is used for high-sensitivity detection of fluorescence.
Liquid recirculating chiller Solid State Cooling Systems Oasis 160 This is used for continuously perfusing the camera with chilled water for maintaining a temperature of -80°C, and thereby reducing noise.
LED CoolLED-Custom Interconnect 490 nm  This light source is used for rapid on/off control of fluorescence excitation.
Image acquisition software Andor Technology Solis
Imaging chamber Warner Instruments RC-21BRFS
Fast perfusion system Warner Instruments SF-77B
CNQX Tocris Bioscience 1045
D,L-AP5 Tocris Bioscience 0106
Tetrodotoxin Tocris Bioscience 1069 Caution: toxic reagent. Handle with care.
FM1-43 Invitrogen T35356
Aldehyde-fixable FM1-43 (FM1-43FX) Invitrogen F35355
FM4-64 Invitrogen T13320
Aldehyde-fixable FM4-64 (FM4-64FX) Invitrogen F34653
Ionomycin Sigma-Aldrich I0634
Hanks’ balanced salt Sigma-Aldrich H2387
Minimum Essential Medium Invitrogen 51200-038 This solution does not contain phenol red that will interfere with fluorescence imaging.
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Caution: toxic reagent. Handle with care.
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
  2. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nat. Protoc. 1, 2916-2921 (2006).
  3. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. . Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes. , 77-83 (2012).
  4. Newton, J., Murthy, V. Measuring exocytosis in neurons using FM labeling. J. Vis. Exp. , (2006).
  5. Evans, G. J., Cousin, M. A. Simultaneous monitoring of three key neuronal functions in primary neuronal cultures. J. Neurosci. Methods. 160, 197-205 (2007).
  6. Cousin, M. A. Use of FM1-43 and other derivatives to investigate neuronal function. Curr. Protoc. Neurosci. 2, (2008).
  7. Clayton, E. L., Cousin, M. A. Quantitative monitoring of activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicle membrane by fluorescent dextran imaging. J. Neurosci. Methods. 185, 76-81 (2009).
  8. Cheung, G., Cousin, M. A. Quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using FM dyes. J. Vis. Exp. , (2011).
  9. Welzel, O., Tischbirek, C. H., Kornhuber, J., Groemer, T. W. Pool-independent labelling of synaptic vesicle exocytosis with single vesicle resolution in rat hippocampal neurons. J. Neurosci. Methods. 205, 258-264 (2012).
  10. Winterer, J., Stanton, P. K., Muller, W. Direct monitoring of vesicular release and uptake in brain slices by multiphoton excitation of the styryl FM 1-43. Biotechniques. 40, 343-351 (2006).
  11. Kay, A. R. Imaging FM dyes in brain slices. Cold Spring Harb. Protoc. , (2007).
  12. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods Mol. Biol. 440, 349-369 (2008).
  13. Amaral, E., Guatimosim, S., Guatimosim, C. Using the fluorescent styryl dye FM1-43 to visualize synaptic vesicles exocytosis and endocytosis in motor nerve terminals. Methods Mol. Biol. 689, 137-148 (2011).
  14. Guatimosim, C., von Gersdorff, H. Optical monitoring of synaptic vesicle trafficking in ribbon synapses. Neurochem. Int. 41, 307-312 (2002).
  15. Joselevitch, C., Zenisek, D. Imaging exocytosis in retinal bipolar cells with TIRF microscopy. J. Vis. Exp. , 1305 (2009).
  16. Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22, 3939-3952 (2002).
  17. Sara, Y., Virmani, T., Deak, F., Liu, X. An isolated pool of vesicles recycles at rest and drives spontaneous neurotransmission. Neuron. 45, 563-573 (2005).
  18. Wilhelm, B. G., Groemer, T. W., Rizzoli, S. O. The same synaptic vesicles drive active and spontaneous release. Nat. Neurosci. 13, 1454-1456 (2010).
  19. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Miniature release events of glutamate from hippocampal neurons are influenced by the dystonia-associated protein torsinA. Synapse. 66, 807-822 (2012).
  20. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Ho, K. W., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Synaptic vesicle recycling is enhanced by torsinA that harbors the DYT1 dystonia mutation. Synapse. 66, 453-464 (2012).
  21. Kavalali, E. T., Klingauf, J., Tsien, R. W. Activity-dependent regulation of synaptic clustering in a hippocampal culture system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 12893-12900 (1999).
  22. Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
  23. Nosyreva, E., Kavalali, E. T. Activity-dependent augmentation of spontaneous neurotransmission during endoplasmic reticulum stress. J. Neurosci. 30, 7358-7368 (2010).
  24. Ryan, T. A., Smith, S. J. Vesicle pool mobilization during action potential firing at hippocampal synapses. Neuron. 14, 983-989 (1995).
  25. Ryan, T. A., Smith, S. J., Reuter, H. The timing of synaptic vesicle endocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 5567-5571 (1996).
  26. Harata, N., et al. Limited numbers of recycling vesicles in small CNS nerve terminals: implications for neural signaling and vesicular cycling. Trends Neurosci. 24, 637-643 (2001).
  27. Klingauf, J., Kavalali, E. T., Tsien, R. W. Kinetics and regulation of fast endocytosis at hippocampal synapses. Nature. 394, 581-585 (1998).
  28. Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J. Cell Biol. 168, 929-939 (2005).
  29. Kay, A. R., et al. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat. Neuron. 24, 809-817 (1999).
  30. Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. An ultrastructural readout of fluorescence recovery after photobleaching using correlative light and electron. 1, 988-994 (2006).
  31. Moulder, K. L., Jiang, X., Taylor, A. A., Benz, A. M., Mennerick, S. Presynaptically silent synapses studied with light microscopy. J. Vis. Exp. , (2010).
  32. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of synaptic activity in hippocampal slices with FM1-43 enabled by fluorescence quenching. Neuron. 24, 803-808 (1999).
  33. Harata, N. C., Choi, S., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Frequency-dependent kinetics and prevalence of kiss-and-run and reuse at hippocampal synapses studied with novel quenching methods. Neuron. 49, 243-256 (2006).
  34. Piedras-Renteria, E. S., et al. Presynaptic homeostasis at CNS nerve terminals compensates for lack of a key Ca2+ entry pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 3609-3614 (2004).
  35. Rosenmund, C., Stevens, C. F. Definition of the readily releasable pool of vesicles at hippocampal synapses. Neuron. 16, 1197-1207 (1996).
  36. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Piedras-Renteria, E. S., Tsien, R. W. Rapid reuse of readily releasable pool vesicles at hippocampal synapses. Neuron. 28, 221-231 (2000).
  37. Kawano, H., et al. Long-term culture of astrocytes attenuates the readily releasable pool of synaptic vesicles. PLoS ONE. 8, (2012).
  38. Harata, N., Katayama, J., Takeshita, Y., Murai, Y., Akaike, N. Two components of metabotropic glutamate responses in acutely dissociated CA3 pyramidal neurons of the rat. Brain Res. 711, 223-233 (1996).
  39. Kira, T., Harata, N., Sakata, T., Akaike, N. Kinetics of sevoflurane action on GABA- and glycine-induced currents in acutely dissociated rat hippocampal neurons. Neuroscience. 85, 383-394 (1998).
  40. Harata, N., Katayama, J., Akaike, N. Excitatory amino acid responses in relay neurons of the rat lateral geniculate nucleus. Neuroscience. 89, 109-125 (1999).
  41. Albeanu, D. F., Soucy, E., Sato, T. F., Meister, M., Murthy, V. N. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS ONE. 3, e2146 (2008).
  42. Neves, G., Lagnado, L. The kinetics of exocytosis and endocytosis in the synaptic terminal of goldfish retinal bipolar cells. J. Physiol. 515, 181-202 (1999).
  43. Mazzone, S. B., et al. Fluorescent styryl dyes FM1-43 and FM2-10 are muscarinic receptor antagonists: intravital visualization of receptor occupancy. J. Physiol. 575, 23-35 (2006).
  44. Gale, J. E., Marcotti, W., Kennedy, H. J., Kros, C. J., Richardson, G. P. FM1-43 dye behaves as a permeant blocker of the hair-cell mechanotransducer channel. J. Neurosci. 21, 7013-7025 (2001).
  45. Li, D., Herault, K., Oheim, M., Ropert, N. FM dyes enter via a store-operated calcium channel and modify calcium signaling of cultured astrocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21960-21965 (2009).
  46. Crumling, M. A., et al. P2X antagonists inhibit styryl dye entry into hair cells. Neuroscience. 161, 1144-1153 (2009).
  47. Zhu, Y., Stevens, C. F. Probing synaptic vesicle fusion by altering mechanical properties of the neuronal surface membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 18018-18022 (2008).
  48. Thiagarajan, T. C., Lindskog, M., Tsien, R. W. Adaptation to synaptic inactivity in hippocampal neurons. Neuron. 47, 725-737 (2005).
  49. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
  50. Li, H., et al. Concurrent imaging of synaptic vesicle recycling and calcium dynamics. Front. Mol. Neurosci. 4, 34 (2011).
  51. Raingo, J., et al. VAMP4 directs synaptic vesicles to a pool that selectively maintains asynchronous neurotransmission. Nat. Neurosci. 15, 738-745 (2012).
  52. Martens, H., et al. Unique luminal localization of VGAT-C terminus allows for selective labeling of active cortical GABAergic synapses. J. Neurosci. 28, 13125-13131 (2008).
  53. Hua, Y., Sinha, R., Martineau, M., Kahms, M., Klingauf, J. A common origin of synaptic vesicles undergoing evoked and spontaneous fusion. Nat. Neurosci. 13, 1451-1453 (2010).
  54. Hua, Y., et al. A readily retrievable pool of synaptic vesicles. Nat. Neurosci. 14, 833-839 (2011).
  55. Groemer, T. W., Klingauf, J. Synaptic vesicles recycling spontaneously and during activity belong to the same vesicle. 10, 145-147 (2007).
  56. Moulder, K. L., et al. A specific role for Ca2+-dependent adenylyl cyclases in recovery from adaptive presynaptic silencing. J. Neurosci. 28, 5159-5168 (2008).
  57. Crawford, D. C., Jiang, X., Taylor, A., Moulder, K. L., Mennerick, S. Differential requirement for protein synthesis in presynaptic unmuting and muting in hippocampal glutamate terminals. PLoS ONE. 7, (2012).
  58. Henkel, A. W., Lubke, J., Betz, W. J. FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 1918-1923 (1996).
  59. Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM 1- 43 photoconversion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 12748-12753 (2001).
  60. Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying synaptic vesicle pools using photoconversion of styryl dyes. J. Vis. Exp. , (2010).
  61. Schikorski, T. Monitoring rapid endocytosis in the electron microscope via photoconversion of vesicles fluorescently labeled with FM1-43. Methods Mol. Biol. 657, 329-346 (2010).
  62. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. FM dye photoconversion for visualizing synaptic vesicles by electron microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2012, 84-86 (2012).
  63. Schote, U., Seelig, J. Interaction of the neuronal marker dye FM1-43 with lipid membranes. Thermodynamics and lipid ordering. Biochim. Biophys. Acta. 1415, 135-146 (1998).
  64. Harata, N. C., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Kiss-and-run and full-collapse fusion as modes of exo-endocytosis in neurosecretion. J. Neurochem. 97, 1546-1570 (2006).

Tags

Synaptic Vesicle RecyclingFM DyesEvoked Synaptic ActivitySpontaneous Synaptic ActivityMiniature Synaptic ActivityMembrane TurnoverHippocampal NeuronsPhotobleaching
check_url/50557?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities. J. Vis. Exp. (85), e50557, doi:10.3791/50557 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image