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Neuroscience

El examen de la vesícula sináptica Reciclaje utilizando tintes FM Durante Evocados, espontánea, y actividades sinápticas miniatura

Published: March 31, 2014
doi:
10.3791/50557
, , , ,
1Department of Molecular Physiology & Biophysics,University of Iowa Carver College of Medicine, 2Department of Biology & Biochemistry,University of Bath

Summary

Se describe el uso de colorantes de estirilo FM a la imagen de reciclado de vesículas sinápticas en las terminales nerviosas funcionales. Este protocolo se puede aplicar no sólo a evocada, sino también espontánea y actividades sinápticas en miniatura. El protocolo se expande la variedad de eventos sinápticas que pueden ser evaluados de manera eficaz.

Abstract

Las vesículas sinápticas en las terminaciones nerviosas funcionales sufren exocitosis y endocitosis. Este reciclaje de vesículas sinápticas puede ser analizada de manera efectiva el uso de tintes estirilo FM, que revelan el volumen de negocios de la membrana. Protocolos convencionales para el uso de colorantes FM fueron diseñados para el análisis de las neuronas siguiente estimulada (evocado) la actividad sináptica. Recientemente, los protocolos se han hecho disponibles para el análisis de las señales de FM que acompañan las actividades sinápticas más débiles, como los eventos sinápticas espontáneas o en miniatura. El análisis de estos pequeños cambios en las señales de FM requiere que el sistema de formación de imágenes es lo suficientemente sensible para detectar pequeños cambios en la intensidad, sin embargo, que los cambios de artefactos de gran amplitud se suprimen. Aquí se describe un protocolo que se puede aplicar a evocado, espontánea, y actividades sinápticas en miniatura, y el uso de las neuronas del hipocampo en cultivo como un ejemplo. Este protocolo también incorpora un medio de evaluar la tasa de fotoblanqueo de tintes FM, ya que es un importantefuente de artefactos cuando se generan imágenes pequeños cambios en la intensidad.

Introduction

La funcionalidad de las vesículas sinápticas es un determinante importante de la transmisión sináptica. Estas vesículas liberan neurotransmisores cuando se fusionan con la membrana plasmática presináptica (exocitosis), y se convierten listo para otro ciclo de la liberación después de ser regenerado a partir de la membrana plasmática (endocitosis) y cargado nuevamente con neurotransmisores. La investigación sobre la dinámica de los mecanismos subyacentes y el reciclado de la vesícula sináptica se ha acelerado en gran medida por la introducción de colorantes estirilo FM 1. Estas moléculas anfipáticas, que se carga positiva grupos de cabeza hidrófilos y colas hidrofóbicas (múltiples colorantes en la Figura 1A, stereoview de FM1-43 en la Figura 1B), de forma reversible pueden entrar y salir de las membranas lipídicas y sin los impregna. Grupos de tintes FM comparten características similares que influyen en el rango de la luz que emiten. Por ejemplo, FM2-10, FM1-43, y FM1-84 tienen un doble enlace entre dos compuestos cíclicos y Shoemisión verde w. La diferencia entre ellos es la longitud de la cola hidrófoba, que determina su hidrofobicidad y por lo tanto la tasa de salida de la membrana (departitioning). En los casos de FM5-95 y FM4-64, tres dobles enlaces enlazan los compuestos cíclicos, y que muestran emisión de color rojo. Estos colorantes difieren con respecto a sus partes hidrófilas. En todos los tintes de FM, la intensidad de fluorescencia aumenta cuando se insertan en las membranas biológicas, debido a un aumento en el rendimiento cuántico en el entorno hidrófobo en relación con el medio ambiente hidrofílico. Por lo tanto los cambios en la intensidad de FM representan los cambios en el volumen de negocios membrana. Los diferentes colores (espectros de emisión) y hidrofobicidades hacen la FM tiñe una herramienta de investigación versátiles en el reciclado de vesículas sinápticas.

Sobre la base de estas características, los colorantes FM se utilizan sobre todo de acuerdo con el siguiente esquema en el análisis de reciclado de la vesícula sináptica (Figura 2). Neuronas son bañadas en una solución extracelular que contiene el colorante FM, lo que le permite ser tomado en vesículas sinápticas (SVS), ya que forman a través de la endocitosis (manchas). El colorante se lava entonces a cabo mediante la aplicación de una solución extracelular libre de colorante, lo que revela las terminales nerviosas funcionales, es decir, sólo aquellos sometidos a endocitosis activamente contendrá un grupo de vesículas sinápticas que se cargan con el colorante (Figura 2 abajo). Exocitosis subsiguiente conduce a la pérdida del colorante de FM para el espacio extracelular y una pérdida concomitante de la fluorescencia (decoloración; debido tanto a la departitioning a un entorno hidrófilo y difusión lejos del sitio de la exocitosis). Por lo tanto los cambios en la intensidad de fluorescencia de FM son indicadores de la vesícula sináptica exo-y endocitosis.

Colorantes FM se han utilizado para manchar y destain las vesículas sinápticas en diversos organismos y preparaciones 2,3. Los ejemplos incluyen neur mamíferosculturas onal 4-9, rodajas de cerebro de mamíferos 10,11, 12,13 uniones neuromusculares, neuronas bipolares de la retina 14,15, y las células ciliadas de la cóclea 16.

Normalmente, en este tipo de experimentos, tanto de tinción y decoloración son provocados por la estimulación de las neuronas extensivamente (actividad evocada). Recientemente, sin embargo, el reciclado de vesículas sinápticas en respuesta a la estimulación débil también ha sido analizado, como tiene el reciclaje en ausencia de un estímulo externo (la actividad sináptica espontánea y miniatura) 9,17-19. Actividades sinápticas espontáneas y en miniatura se definen como los que ocurren en ausencia de estímulos externos, con el primero que implica la activación espontánea de los potenciales de acción (Figura 3). Estas actividades sinápticas débiles se asocian con cambios más pequeños en las señales de FM que los desencadenados por la extensa estimulación. La medición requiere que los cambios en colg FMintensidad rencia refleja con exactitud la exocitosis de vesículas sinápticas o endocitosis pero los cambios no artifactual en intensidad. Una de las causas del artefacto es la presencia de tinción no específica de la membrana plasmática por los colorantes FM. Lavado gradual de este componente dará lugar a un cambio gradual en la intensidad de fluorescencia medida, que se atribuye erróneamente a las actividades sinápticas. Este factor se puede reducir por métodos apropiados (véase el Protocolo). La causa más notable del artefacto es el fotoblanqueo de colorante de FM retenido dentro de vesículas sinápticas. Los cambios relacionados con photobleaching-en la intensidad de FM deben ser pequeños en comparación con los biológicos (sinápticas) los cambios que se miden. El reciente desarrollo de cámaras sensibles, por ejemplo, la cámara del dispositivo de acoplamiento de carga de electrones multiplicando (EMCCD), hace que sea posible para reducir al mínimo photobleaching acortando el tiempo de exposición y el debilitamiento de la intensidad de la luz usada para excitar el fluoróforo. Otra causa del artefacto es un i driftn el nivel de enfoque de microscopio de luz. La deriva de enfoque durante una sesión de formación de imágenes puede ser causada por efectos mecánicos o térmicos, y se erróneamente conducir a un cambio en la intensidad de fluorescencia medida.

Aquí se describen los protocolos y equipos que hacen posible el uso de colorantes FM para analizar el reciclado de vesículas sinápticas incluso en el contexto de débil o ninguna estimulación, en particular, la actividad sináptica en miniatura. Mostramos ejemplos de la tinción y decoloración de las vesículas sinápticas durante los eventos evocados y espontáneos, utilizando neuronas del hipocampo de roedores cultivadas, y formación de imágenes de la fase de decoloración. También demostramos cómo evaluar el grado de FM tinte fotoblanqueo, en ausencia de cualquier pérdida de colorante FM debido a las actividades sinápticas.

Protocol

1. Cultivo primario de neuronas de cerebro de los mamíferos Todos los animales procedimientos realizados en este estudio han sido aprobados por el Comité de la Universidad de Iowa Institucional Cuidado de Animales y el uso. Preparar el cultivo de células disociadas de las regiones CA3-CA1 del hipocampo de ratones o ratas en los días postnatales 0-1 19,20. Placa de las células del hipocampo en cubreobjetos de 12 mm (espesor número 0) preconfiguradas con la capa ali…

Representative Results

A modo de ejemplo, mostramos los resultados representativos de la evolución en el tiempo de decoloración de las vesículas sinápticas (Figura 4). Las neuronas del hipocampo cultivadas se tiñeron con FM4-64 utilizando la actividad sináptica espontánea (paso 2,3) y se lavaron con solución libre de colorante (solución de lavado 2). La imagen muestra el curso inicial de tiempo de decoloración utilizando la actividad espontánea (paso 5.3) (parte inicial de la línea continua de la Figura 4A…

Discussion

Hemos descrito protocolos para la tinción y la decoloración se deben vesículas sinápticas en respuesta a evocado, la actividad sináptica espontánea y miniatura, y para formación de imágenes durante la fase de decoloración. Además de los protocolos existentes, se ha incluido un nuevo protocolo de observación de la decoloración FM basado en la actividad sináptica en miniatura. El uso de estos protocolos, hemos identificado previamente anormalidades en las neuronas cultivadas a partir de un modelo de ratón de…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen a los miembros del laboratorio Harata útil para los debates a lo largo de la ejecución de este trabajo. Este trabajo fue financiado por becas de la Asociación Americana del Corazón, la Fundación Distonía Investigación Médica, el Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation, la Fundación Nacional de Ciencias y la Fundación Whitehall a NCH

Materials

Pulse generator AMPI Master-8
Isolated stimulator Digitimer DS3
Inverted microscope Nikon Eclipse TS100 This is used for assessing the cell morphology at low magnification.
Inverted microscope Nikon Eclipse TiE This is used for high-resolution fluorescence and transmitted light imaging, with minimal focus drift.
Objective lens Nikon Water-immersion lens is recommended. Oil-immersion lens is usable unless an imaged structure is deep from the coverslip surface (e.g. >10 μm).
Filter cube Nikon 77032509 490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em for FM1-43
Filter cube Nikon 77032809 490/20-nm ex, 510-nm dclp, 650-nm-LP em for FM4-64. 
EMCCD camera Andor Technology iXon EM+ DU-860 This EMCCD camera is used for high-sensitivity detection of fluorescence.
Liquid recirculating chiller Solid State Cooling Systems Oasis 160 This is used for continuously perfusing the camera with chilled water for maintaining a temperature of -80°C, and thereby reducing noise.
LED CoolLED-Custom Interconnect 490 nm  This light source is used for rapid on/off control of fluorescence excitation.
Image acquisition software Andor Technology Solis
Imaging chamber Warner Instruments RC-21BRFS
Fast perfusion system Warner Instruments SF-77B
CNQX Tocris Bioscience 1045
D,L-AP5 Tocris Bioscience 0106
Tetrodotoxin Tocris Bioscience 1069 Caution: toxic reagent. Handle with care.
FM1-43 Invitrogen T35356
Aldehyde-fixable FM1-43 (FM1-43FX) Invitrogen F35355
FM4-64 Invitrogen T13320
Aldehyde-fixable FM4-64 (FM4-64FX) Invitrogen F34653
Ionomycin Sigma-Aldrich I0634
Hanks’ balanced salt Sigma-Aldrich H2387
Minimum Essential Medium Invitrogen 51200-038 This solution does not contain phenol red that will interfere with fluorescence imaging.
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Caution: toxic reagent. Handle with care.
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
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Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities. J. Vis. Exp. (85), e50557, doi:10.3791/50557 (2014).
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