पैदा की, सहज, और लघु Synaptic गतिविधियों के दौरान एफएम रंगों का उपयोग synaptic पुटिका रीसाइक्लिंग के परीक्षा
Summary
हम कार्यात्मक तंत्रिका टर्मिनलों में छवि synaptic पुटिका रीसाइक्लिंग के लिए styryl एफएम रंगों के उपयोग का वर्णन. इस प्रोटोकॉल न केवल पैदा करने के लिए, लेकिन यह भी सहज और लघु synaptic गतिविधियों लागू किया जा सकता है. प्रोटोकॉल को प्रभावी ढंग से मूल्यांकन किया जा सकता है कि synaptic घटनाओं की विविधता बढ़ती है.
Abstract
कार्यात्मक तंत्रिका टर्मिनलों में synaptic vesicles एक्सोसाइटोसिस और endocytosis गुजरना. इस synaptic पुटिका रीसाइक्लिंग प्रभावी ढंग से झिल्ली कारोबार प्रकट जो styryl एफएम रंजक, उपयोग विश्लेषण किया जा सकता है. एफएम रंगों के उपयोग के लिए पारंपरिक प्रोटोकॉल उत्तेजित (पैदा) synaptic गतिविधि निम्नलिखित न्यूरॉन्स का विश्लेषण करने के लिए डिजाइन किए गए थे. हाल ही में, प्रोटोकॉल ऐसे सहज या लघु synaptic घटनाओं के रूप में कमजोर synaptic गतिविधियों, के साथ कि एफएम संकेतों का विश्लेषण करने के लिए उपलब्ध हो गए हैं. एफएम संकेतों में इन छोटे परिवर्तन का विश्लेषण इमेजिंग प्रणाली तीव्रता में छोटे परिवर्तन का पता लगाने के लिए पर्याप्त रूप से संवेदनशील है, अभी तक बड़े आयाम की कि artifactual परिवर्तन दबा रहे हैं कि आवश्यकता है. यहाँ हम पैदा की सहज, और लघु synaptic गतिविधियों, और एक उदाहरण के रूप में संवर्धित hippocampal न्यूरॉन्स उपयोग करने के लिए लागू किया जा सकता है कि एक प्रोटोकॉल का वर्णन. यह एक महत्वपूर्ण है के रूप में इस प्रोटोकॉल, एफएम रंगों की photobleaching की दर का आकलन करने का एक साधन शामिलतीव्रता में छोटे परिवर्तन जब इमेजिंग कलाकृतियों का स्रोत.
Introduction
synaptic vesicles के कार्यक्षमता synaptic प्रसारण का एक महत्वपूर्ण निर्धारक है. वे presynaptic प्लाज्मा झिल्ली (एक्सोसाइटोसिस) के साथ फ्यूज जब इन vesicles न्यूरोट्रांसमीटर जारी है, और वे प्लाज्मा झिल्ली (endocytosis) से पुनर्जीवित और neurotransmitter के साथ पुनः लोड होने के बाद रिहाई का एक और चक्र के लिए तैयार हो जाते हैं. की गतिशीलता और synaptic पुटिका रीसाइक्लिंग अंतर्निहित तंत्र में अनुसंधान काफी styryl एफएम रंजक 1 के लागू होने से त्वरित किया गया है. सकारात्मक (चित्रा 1 ए, चित्रा 1 बी में FM1-43 के stereoview में कई रंगों) हाइड्रोफिलिक सिर समूहों और हाइड्रोफोबिक पूंछ का आरोप लगाया है, जो इन amphipathic अणु, reversibly भरिये और उन्हें permeating बिना लिपिड झिल्ली बाहर कर सकते हैं. एफएम रंगों के समूह कि वे उत्सर्जन प्रकाश की सीमा को प्रभावित है कि इसी तरह की सुविधाओं को साझा करें. उदाहरण के लिए, FM2-10, FM1-43, और FM1-84 दो चक्रीय यौगिकों और थानेदार के बीच एक डबल बांड हैडब्ल्यू हरी उत्सर्जन. उन दोनों के बीच का अंतर अपने hydrophobicity निर्धारित करता है और इसलिए झिल्ली से बाहर निकलने की दर (departitioning) जो हाइड्रोफोबिक पूंछ की लंबाई है. FM5 -95 और FM4-64 के मामलों में, तीन डबल बांड चक्रीय यौगिकों लिंक, और वे लाल उत्सर्जन दिखा. इन रंगों को अपने हाइड्रोफिलिक भागों के संबंध में मतभेद है. वे कारण हाइड्रोफिलिक पर्यावरण के लिए हाइड्रोफोबिक पर्यावरण सापेक्ष में क्वांटम उपज में वृद्धि करने के लिए, जैविक झिल्ली में डाला जाता है जब सभी एफएम रंगों में, प्रतिदीप्ति तीव्रता बढ़ जाती है. इस प्रकार एफएम तीव्रता में परिवर्तन झिल्ली कारोबार में परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करते हैं. अलग अलग रंग (उत्सर्जन स्पेक्ट्रा) और hydrophobicities एफएम synaptic पुटिका रीसाइक्लिंग में एक बहुमुखी अनुसंधान उपकरण रंजक बनाने.
इन सुविधाओं के आधार पर, एफएम रंगों ज्यादातर synaptic पुटिका रीसाइक्लिंग विश्लेषण करते समय निम्न योजना (चित्रा 2) के अनुसार किया जाता है. न्यूरॉनवे endocytosis (धुंधला) के माध्यम से फार्म के रूप में है synaptic vesicles (SVs) में शुरू किए जाने वाले इसे सक्रिय करने, एफएम डाई युक्त एक कोशिकी समाधान में स्नान कर रहे हैं. डाई तो एक डाई मुक्त कोशिकी समाधान को लागू करने से बाहर धोया जाता है, इस यानी केवल उन सक्रिय रूप से दौर से गुजर endocytosis डाई (चित्रा 2 नीचे) के साथ लोड कर रहे हैं कि synaptic vesicles के एक क्लस्टर में शामिल होंगे कार्यात्मक तंत्रिका टर्मिनलों, पता चलता है. इसके बाद एक्सोसाइटोसिस बाह्य अंतरिक्ष के लिए एफएम डाई की हानि और प्रतिदीप्ति की एक सहवर्ती नुकसान होता है (destaining; कारण एक हाइड्रोफिलिक पर्यावरण के लिए departitioning और दूर एक्सोसाइटोसिस की साइट से प्रसार करने के लिए दोनों). इसलिए एफएम प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन synaptic पुटिका Exo और endocytosis के संकेतक हैं.
एफएम रंजक विभिन्न जीवों और तैयारी 2,3 में synaptic vesicles दाग और destain के लिए इस्तेमाल किया गया है. उदाहरण स्तनधारी neur शामिलonal संस्कृतियों 4-9, स्तनधारी मस्तिष्क स्लाइसें 10,11, neuromuscular जंक्शनों 12,13, रेटिना द्विध्रुवी न्यूरॉन्स 14,15, और कोक्लीअ 16 के बालों की कोशिकाओं.
आमतौर पर इस तरह के प्रयोगों में, धुंधला और destaining दोनों बड़े पैमाने पर न्यूरॉन्स (पैदा की गतिविधि) उत्तेजक से शुरू हो रहे. एक बाह्य प्रेरणा (सहज और लघु synaptic गतिविधि) 9,17-19 के अभाव में पुनर्चक्रण के रूप में हाल ही में, हालांकि, कमजोर उत्तेजना के जवाब में synaptic पुटिका रीसाइक्लिंग भी, विश्लेषण किया गया है. सहज और लघु synaptic गतिविधियों कार्रवाई क्षमता का सहज फायरिंग (चित्रा 3) से जुड़े पूर्व के साथ, बाहरी उत्तेजनाओं के अभाव में होते हैं कि उन के रूप में परिभाषित कर रहे हैं. इन कमजोर synaptic गतिविधियों व्यापक उत्तेजना से चालू होने वाले लोगों की तुलना में एफएम संकेतों में छोटे परिवर्तन के साथ जुड़े रहे हैं. माप की आवश्यकता है कि एफएम fluoresc में परिवर्तनखिलाडि़यों तीव्रता सही synaptic पुटिका एक्सोसाइटोसिस या endocytosis लेकिन तीव्रता में artifactual नहीं परिवर्तन को प्रतिबिंबित. विरूपण साक्ष्य का एक कारण एफएम रंगों से प्लाज्मा झिल्ली की अविशिष्ट धुंधला की उपस्थिति है. इस घटक के क्रमिक वार्शआउट ग़लती synaptic गतिविधियों के लिए जिम्मेदार माना जा जाएगा जो मापा प्रतिदीप्ति तीव्रता में एक क्रमिक परिवर्तन हो जाएगा. यह पहलू (प्रोटोकॉल देखें) उचित तरीके से कम किया जा सकता है. विरूपण साक्ष्य की सबसे उल्लेखनीय कारण synaptic vesicles भीतर बनाए रखा एफएम डाई की photobleaching है. एफएम तीव्रता में photobleaching से संबंधित परिवर्तन मापा जाता है कि जैविक (synaptic) परिवर्तन की तुलना में छोटा होना चाहिए. संवेदनशील कैमरों की हाल ही में विकास, जैसे इलेक्ट्रॉन गुणा प्रभारी युग्मित डिवाइस (EMCCD) कैमरा, यह संभव जोखिम समय छोटा और फ्लोरोफोरे उत्तेजित करने के लिए प्रयोग किया जाता प्रकाश की तीव्रता को कमजोर करके photobleaching कम करने के लिए बनाता है. विरूपण साक्ष्य का एक अन्य कारण एक बहाव मैं हैn प्रकाश माइक्रोस्कोप से ध्यान केंद्रित स्तर. एक इमेजिंग सत्र के दौरान ध्यान केंद्रित बहाव यांत्रिक या थर्मल प्रभाव की वजह से हो सकता है, और ग़लती से मापा प्रतिदीप्ति तीव्रता में एक परिवर्तन को बढ़ावा मिलेगा.
यहाँ हम यह संभव विशेष रूप से, लघु synaptic गतिविधि, भी कमजोर या कोई उत्तेजना के संदर्भ में synaptic पुटिका रीसाइक्लिंग का विश्लेषण करने के लिए एफएम रंगों का उपयोग करने के लिए बनाते हैं कि प्रोटोकॉल और उपकरणों का वर्णन. हम सभ्य कृंतक hippocampal न्यूरॉन्स का उपयोग कर, और destaining चरण इमेजिंग, पैदा की और सहज synaptic घटनाओं के दौरान vesicles के धुंधला हो जाना और destaining के उदाहरण दिखाते हैं. हम यह भी कारण synaptic गतिविधियों के लिए किसी भी एफएम डाई नुकसान के अभाव में, एफएम डाई photobleaching की डिग्री का मूल्यांकन करने के लिए कैसे प्रदर्शित करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
हम सहज और लघु synaptic गतिविधि पैदा की, और destaining चरण के दौरान इमेजिंग के लिए के जवाब में synaptic vesicles धुंधला और destaining के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया है. मौजूदा प्रोटोकॉल के अलावा, हम लघु synaptic गतिविधि पर आधारित एफएम destaining दे…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक इस कार्य के निष्पादन के दौरान उपयोगी विचार विमर्श के लिए Harata प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद. इस काम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन, Dystonia मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन, एडवर्ड Mallinckrodt, जूनियर फाउंडेशन, राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन, और एनसीएच को व्हाइटहॉल फाउंडेशन से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया
Materials
| Pulse generator | AMPI | Master-8 | |
| Isolated stimulator | Digitimer | DS3 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100 | This is used for assessing the cell morphology at low magnification. |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TiE | This is used for high-resolution fluorescence and transmitted light imaging, with minimal focus drift. |
| Objective lens | Nikon | Water-immersion lens is recommended. Oil-immersion lens is usable unless an imaged structure is deep from the coverslip surface (e.g. >10 μm). | |
| Filter cube | Nikon | 77032509 | 490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em for FM1-43 |
| Filter cube | Nikon | 77032809 | 490/20-nm ex, 510-nm dclp, 650-nm-LP em for FM4-64. |
| EMCCD camera | Andor Technology | iXon EM+ DU-860 | This EMCCD camera is used for high-sensitivity detection of fluorescence. |
| Liquid recirculating chiller | Solid State Cooling Systems | Oasis 160 | This is used for continuously perfusing the camera with chilled water for maintaining a temperature of -80°C, and thereby reducing noise. |
| LED | CoolLED-Custom Interconnect | 490 nm | This light source is used for rapid on/off control of fluorescence excitation. |
| Image acquisition software | Andor Technology | Solis | |
| Imaging chamber | Warner Instruments | RC-21BRFS | |
| Fast perfusion system | Warner Instruments | SF-77B | |
| CNQX | Tocris Bioscience | 1045 | |
| D,L-AP5 | Tocris Bioscience | 0106 | |
| Tetrodotoxin | Tocris Bioscience | 1069 | Caution: toxic reagent. Handle with care. |
| FM1-43 | Invitrogen | T35356 | |
| Aldehyde-fixable FM1-43 (FM1-43FX) | Invitrogen | F35355 | |
| FM4-64 | Invitrogen | T13320 | |
| Aldehyde-fixable FM4-64 (FM4-64FX) | Invitrogen | F34653 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| Hanks’ balanced salt | Sigma-Aldrich | H2387 | |
| Minimum Essential Medium | Invitrogen | 51200-038 | This solution does not contain phenol red that will interfere with fluorescence imaging. |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Caution: toxic reagent. Handle with care. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 |
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