Undersøkelse av Synaptic Vesikkel Recycling Bruke FM Fargestoffer Under fremkalt, spontan, og miniatyr Synaptic Aktiviteter

Summary

Vi beskriver bruk av styryl FM fargestoffer til bilde synaptisk vesikkel gjenvinning i funksjonelle nerveterminaler. Denne protokoll kan anvendes ikke bare for å fremkalt, men også spontan og miniatyr synaptiske aktiviteter. Protokollen utvider rekke synaptiske hendelser som kan effektivt evaluert.

Abstract

Synaptiske vesikler i funksjonelle nerveterminaler gjennomgå eksocytose og endocytose. Dette synaptisk vesikkel gjenvinning kan være effektivt analysert ved hjelp styryl FM fargestoffer, som avslører membran omsetning. Konvensjonelle protokoller for bruk av FM-fargestoffer ble designet for å analysere nevroner følgende stimulert (fremkalt) synaptiske aktivitet. Nylig har protokoller blir tilgjengelige for å analysere FM-signaler som følger svakere synaptiske aktiviteter, for eksempel spontane eller miniatyr synaptiske hendelser. Analyse av disse små endringer i FM-signaler krever at avbildningssystem er tilstrekkelig følsomt til å detektere små forandringer i intensiteten, men at kunstig endring av stor amplitude undertrykkes. Her beskriver vi en protokoll som kan brukes til å fremkalt, spontan, og miniatyr synaptiske aktiviteter, og bruke dyrkede hippocampus nevroner som et eksempel. Denne protokollen inneholder også et middel for å vurdere graden av fotobleking av FM-fargestoffer, da dette er en betydeligkilde av gjenstander når imaging små endringer i intensitet.

Introduction

Funksjonaliteten av synaptiske vesikler er en viktig determinant av synaptisk transmisjon. Disse vesikler slipper nevrotransmittere når de smelter sammen med den presynaptiske plasmamembran (eksocytose), og de blir klar for en ny syklus av utgivelsen etter å ha blitt regenerert fra plasmamembranen (endocytose) og lastes med nevrotransmitter. Forskning på dynamikken i og mekanismene bak synaptisk vesikkel gjenvinning har blitt kraftig fremskyndet av innføringen av styryl FM fargestoffer ^en. Disse amphipathic molekyler, som har positivt ladede vanntiltrekkende leder grupper og hydrofobe haler (flere fargestoffer i figur 1A, stereoview av FM1-43 i figur 1B), kan reversibelt inn og ut lipid membraner uten gjennomsyre dem. Grupper av FM fargestoffer dele lignende funksjoner som påvirker omfanget av lys som de slipper ut. For eksempel, FM2-10, FM1-43, og FM1-84 har en dobbeltbinding mellom to cykliske forbindelser og show grønn utslipp. Forskjellen mellom dem er lengden av den hydrofobe halen, som bestemmer dens hydrofobisitet og dermed hastigheten av utgangen fra membranen (departitioning). I de tilfeller av FM5-95 og FM4-64, tre dobbeltbindinger koble de sykliske forbindelser, og de viser røde utslipp. Disse fargestoffer forskjellige med hensyn til sine hydrofile deler. I alle FM-fargestoffer, øker fluorescensintensiteten når de blir satt inn i biologiske membraner, på grunn av en økning i kvanteutbytte i det hydrofobe miljø i forhold til det hydrofile miljø. Dermed endringene i FM intensitet representerer endringene i membranen omsetning. De ulike fargene (utslipp spektra) og hydrofobisiteter gjør FM fargestoffer en allsidig forskningsverktøy i synaptisk vesikkel resirkulering.

Basert på disse funksjonene, er FM-fargestoffer for det meste brukt i henhold til følgende skjema når analysere synaptisk vesikkel gjenvinning (figur 2). Neurons er badet i et ekstracellulært løsning som inneholder FM fargestoff, slik at det å bli tatt opp i synaptiske vesikler (SVS) som de danner via endocytose (flekker). Fargestoffet blir deretter vasket ut ved å anvende et fargestoff-fritt ekstracellulær løsning, og dette viser de funksjonelle nerveterminaler, dvs. bare de aktivt gjennomgår endocytose vil inneholde en klynge av synaptiske vesikler som er lastet med fargestoffet (figur 2 på undersiden). Etterfølgende eksocytose fører til tap av FM fargestoff til ekstracellulære rom og en samtidig tap av fluorescens (avfarging, på grunn av både departitioning til en hydrofil miljø og diffusjon bort fra stedet av eksocytose). Derfor endringene i FM fluorescens intensitet er indikatorer på synaptisk vesikkel exo-og endocytose.

FM fargestoffer har blitt brukt til å farge og destain de synaptiske vesikler i ulike organismer og preparater ^2,3. Eksempler inkluderer pattedyr neuronal kulturer ^4-9, pattedyr hjernen skiver ^10,11, nevromuskulære veikryss ^12,13, retinal bipolare nevroner ^14,15, og hårcellene i cochlea ^16.

Typisk i slike forsøk, blir både farging og avfarging utløst av stor utstrekning å stimulere nervecellene (fremkalt aktivitet). Nylig har imidlertid synaptisk vesikkel gjenvinning i respons til svak stimulering har også blitt analysert, som har resirkulering i fravær av en ekstern stimulus (spontan og miniatyr-synaptisk aktivitet) ^9,17-19. Spontane og miniatyr synaptiske aktiviteter er definert som de som forekommer i fravær av eksterne stimuli, med den tidligere involverer spontan avfyring av aksjonspotensialer (figur 3). Disse svake synaptiske aktiviteter er forbundet med mindre endringer i FM-signaler enn de som utløses av omfattende stimulering. Målingen krever at endringene i FM fluorescerendeence intensitet nøyaktig reflektere synaptisk vesikkel eksocytose eller endocytose men ikke kunstig endringer i intensitet. En årsak til at gjenstanden er tilstedeværelsen av ikke-spesifikk farging av plasmamembranen av FM-fargestoffer. Gradvis utvasking av denne komponenten vil føre til en gradvis endring i den målte fluorescens intensitet, som vil bli feilaktig tilskrives synaptisk aktivitet. Denne faktoren kan reduseres ved hjelp av egnede metoder (se Protocol). Det mest bemerkelsesverdige årsaken til gjenstanden er fotobleking av FM fargestoff beholdes i synaptiske vesikler. De fotobleking relaterte endringer i FM intensitet må være liten i forhold til de biologiske (synaptic) endringer som er målt. Den siste utviklingen av følsomme kameraer, f.eks elektron-multiplisere charge-coupled device (EMCCD) kamera, som gjør det mulig å minimalisere fotobleking ved å korte eksponeringstid og svekke intensiteten til lyset som brukes for å eksitere fluoroforen. En annen årsak til gjenstanden er en drift in fokuserings nivå av lysmikroskop. Fokuset drift under en avbildning sesjon kan være forårsaket av mekaniske eller termiske effekter, og vil feilaktig føre til en endring i den målte fluorescens intensitet.

Her beskriver vi protokoller og utstyr som gjør det mulig å bruke FM-fargestoffer for å analysere synaptiske vesikkel resirkulering til og i sammenheng med svak eller ingen stimulering, særlig miniatyr synaptisk aktivitet. Vi viser eksempler på farging og avfarging av vesikler under fremkalt og spontane synaptiske hendelser, bruk av kultur gnager hippocampus nevroner, og bildebehandling avfarging fasen. Vi viser også hvordan man skal vurdere graden av FM fargestoff fotobleking, i fravær av en hvilken som helst FM fargestoff tap på grunn av synaptisk aktivitet.

Protocol

En. Primær Culture av nerveceller fra pattedyrhjernen Alle dyr prosedyrer utført i denne studien er godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Iowa. Klargjør dissociated cellekultur av CA3-CA1 regioner i hippocampus fra mus eller rotter dager etter fødsel 0-1 19,20. Plate de hippocampus celler på 12-mm dekkglass (tykkelse nummer 0) preseeded med rotte glial matersjikt, i 24-brønn retter, og ved en densitet på 12.000 celler / brønn. <…

Representative Results

Som et eksempel kan vi vise representative resultater for avfarging tidsforløpet av synaptiske vesikler (Fig. 4). Dyrkede hippocampus-neuroner ble farget med FM4-64 ved hjelp av den spontane synaptisk aktivitet (trinn 2.3) og vasket med fargestoff-fri løsning (Renseoppløsning 2). Den avbildning viser den innledende avfarging tidsforløpet ved hjelp av spontan aktivitet (trinn 5.3) (første del av kontinuerlig linje, figur 4A). Dette blir etterfulgt av avfarging tidsforløpet ved hjel…

Discussion

Vi har beskrevet protokoller for farging og avfarging synaptiske vesikler som reaksjon på fremkalt, spontan og miniatyr-synaptisk aktivitet, og for avbildning under avfarging fase. I tillegg til de eksisterende protokoller, har vi inkludert en ny protokoll for å observere FM avfarging basert på miniatyr synaptiske aktivitet. Ved hjelp av disse protokollene, vi tidligere identifisert avvik i dyrkede nerveceller fra en mus modell av bevegelse lidelse dystoni. I forhold til sine kolleger i villtype mus, gjennomgikk diss…

Materials

Pulse generator	AMPI	Master-8
Isolated stimulator	Digitimer	DS3
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TS100	This is used for assessing the cell morphology at low magnification.
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TiE	This is used for high-resolution fluorescence and transmitted light imaging, with minimal focus drift.
Objective lens	Nikon		Water-immersion lens is recommended. Oil-immersion lens is usable unless an imaged structure is deep from the coverslip surface (e.g. >10 μm).
Filter cube	Nikon	77032509	490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em for FM1-43
Filter cube	Nikon	77032809	490/20-nm ex, 510-nm dclp, 650-nm-LP em for FM4-64.
EMCCD camera	Andor Technology	iXon EM+ DU-860	This EMCCD camera is used for high-sensitivity detection of fluorescence.
Liquid recirculating chiller	Solid State Cooling Systems	Oasis 160	This is used for continuously perfusing the camera with chilled water for maintaining a temperature of -80°C, and thereby reducing noise.
LED	CoolLED-Custom Interconnect	490 nm	This light source is used for rapid on/off control of fluorescence excitation.
Image acquisition software	Andor Technology	Solis
Imaging chamber	Warner Instruments	RC-21BRFS
Fast perfusion system	Warner Instruments	SF-77B
CNQX	Tocris Bioscience	1045
D,L-AP5	Tocris Bioscience	0106
Tetrodotoxin	Tocris Bioscience	1069	Caution: toxic reagent. Handle with care.
FM1-43	Invitrogen	T35356
Aldehyde-fixable FM1-43 (FM1-43FX)	Invitrogen	F35355
FM4-64	Invitrogen	T13320
Aldehyde-fixable FM4-64 (FM4-64FX)	Invitrogen	F34653
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I0634
Hanks’ balanced salt	Sigma-Aldrich	H2387
Minimum Essential Medium	Invitrogen	51200-038	This solution does not contain phenol red that will interfere with fluorescence imaging.
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Caution: toxic reagent. Handle with care.
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903