Undersökning av synaptiska vesikler återvinning Använda FM Färgämnen Under Evoked, Spontan, och miniatyr Synaptic aktiviteter

Summary

Vi beskriver användningen av styryl FM-färgämnen för att bilden synaptiska vesikler återvinning i funktionella nervterminaler. Detta protokoll kan användas inte bara för att framkallas, men även spontana och miniatyr synaptiska aktiviteter. Protokollet expanderar sorten av synaptiska händelser som effektivt kan utvärderas.

Abstract

Synaptic blåsor i funktionella nervterminaler genomgår exocytos och endocytos. Denna synaptiska vesikler återvinning kan vara ett effektivt sätt analyseras med styryl FM-färgämnen, som avslöjar membran omsättning. Konventionella protokoll för användning av FM-färgämnen har utformats för att analysera nervceller efter stimulerad (framkallade) synaptisk aktivitet. Nyligen har protokoll blivit tillgängliga för analys av FM-signaler som följer svagare synaptiska aktiviteter, såsom spontana eller miniatyr synaptiska händelser. Analys av dessa små förändringar i FM-signaler kräver att avbildningssystemet är tillräckligt känsliga för att detektera små förändringar i intensitet, men ändå att artefaktförändringar stor amplitud undertrycks. Här beskriver vi ett protokoll som kan användas för att framkallas, spontan, och miniatyr synaptiska aktiviteter, och använda odlade hippocampus nervceller som exempel. Protokollet innehåller också ett medel för att bedöma graden av fotoblekning av FM-färgämnen, eftersom detta är en viktigkälla till artefakter vid avbildande av små förändringar i intensitet.

Introduction

Funktionaliteten av synaptiska vesiklar är en viktig bestämmande faktor av synaptisk transmission. Dessa blåsor frigör signalsubstanser när de smälter samman med det presynaptiska plasmamembranet (exocytos), och de blir redo för en annan cykel för övergång efter att regenereras från plasmamembranet (endocytos) och lastas med signalsubstans. Forskning om dynamik och mekanismerna bakom synaptiska vesikler återvinning har kraftigt påskyndas genom införandet av styryl FM-färgämnen ^1. Dessa amfipatiska molekyler, vilket positivt har laddade hydrofila huvudgrupperna och hydrofoba svansar (flera färgämnen i figur 1 A, stereo av FM1-43 i Figur 1B), kan reversibelt in och ut lipidmembran utan genomsyrar dem. Grupper av FM-färgämnen har liknande egenskaper som påverkar utbudet av ljuset att de släpper ut. Till exempel, FM2-10, FM1-43, och FM1-84 har en dubbelbindning mellan två cykliska föreningar och show grön emission. Skillnaden mellan dem är längden av den hydrofoba svansen, som bestämmer dess hydrofobicitet och därför hastigheten för utträde från membranet (departitioning). I fallen av FM5-95 och FM4-64, tre dubbelbindningar länka de cykliska föreningarna, och de visar röd emission. Dessa färgämnen skiljer sig åt med avseende på deras hydrofila delar. I alla FM-färgämnen, ökar fluorescensintensiteten när de förs in i biologiska membran, beroende på en ökning i kvantutbyte i den hydrofoba miljön i förhållande till den hydrofila miljön. Således förändringarna i FM intensitet representerar de förändringar i membran omsättning. De olika färgerna (emissionsspektra) och hydrofobiciteter gör FM-färgämnen ett mångsidigt forskningsverktyg i synaptiska vesikler återvinning.

Baserat på dessa funktioner är FM-färgämnen används främst enligt följande schema vid analys av synaptiska vesikler återvinning (Figur 2). Neurons badar i en extracellulär lösning innehållande FM färgämne, så att det kan tas upp in i synaptiska vesiklar (SVS), som de bildar via endocytos (missfärgning). Färgen tvättas sedan ut genom att applicera en färgfritt cellulära lösning, vilket avslöjar de funktionella nervterminaler, dvs endast de som aktivt genomgår endocytos kommer att innehålla ett kluster av synaptiska vesiklar som är laddade med färgämnet (Figur 2 botten). Efterföljande exocytos leder till förlust av den FM-färgämne till det extracellulära utrymmet och en åtföljande förlust av fluorescens (avfärgning, på grund av både departitioning till en hydrofil miljö och diffusion iväg från stället för exocytos). Förändringarna i FM-fluorescensintensiteten är därför indikatorer på synaptiska vesikler exo-och endocytos.

FM-färgämnen har använts för att färga och Avfärga synaptiska blåsor i olika organismer och preparat ^2,3. Exempel innefattar däggdjurs neuronal kulturer ^4-9, däggdjur hjärnan skivor ^10,11, neuromuskulära korsningar ^12,13, retinal bipolära nervceller ^14,15, och hårcellerna i snäckan ^16.

Vanligtvis i sådana experiment, är både färgning och avfärgning utlöses av utför stimulera nervceller (framkallat aktivitet). Nyligen dock synaptiska vesikler återvinning som svar på svag stimulering har också analyserats, liksom återvinning i frånvaro av en yttre stimulans (spontan och miniatyr synaptisk aktivitet) ^9,17-19. Spontana och miniatyr synaptiska verksamhet definieras som de som förekommer i frånvaro av yttre stimuli, med den förra involverar spontan bränning av aktionspotentialer (Figur 3). Dessa svaga synaptiska aktiviteter är förknippade med mindre förändringar i FM-signaler än de som utlöstes av omfattande stimulering. Mätningen kräver att förändringarna i FM fluorescerrens intensitet avspeglar exakt synaptiska vesikler exocytosis eller endocytos men inte artefaktuella förändringar i intensitet. En orsak till att artefakten är förekomsten av icke-specifik färgning av plasmamembranet genom FM-färgämnen. Gradvis uttvättning av denna komponent kommer att leda till en gradvis förändring i den uppmätta fluorescensintensiteten, som kommer att felaktigt skrivas synaptiska aktiviteter. Denna faktor kan minskas genom lämpliga metoder (se protokoll). Den mest anmärkningsvärda orsaken till artefakten är fotoblekning av FM färgämne kvar i synaptiska vesiklar. Fotoblekning relaterade förändringar i FM-intensitet måste vara små i jämförelse med de biologiska (synaptic) förändringar som mäts. Den senaste utvecklingen av känsliga kameror, t ex elektron multiplicera laddningskopplad anordning (EMCCD) kamera, gör det möjligt att minimera fotoblekning genom att korta exponeringstid och försvagar intensiteten hos det ljus som används för att excitera fluoroforen. En annan orsak till artefakten är en drift in fokuseringsnivå ljusmikroskop. Fokus Avvikelsen under en avbildning session kan orsakas av mekaniska eller termiska effekter och kommer felaktigt att leda till en förändring av den uppmätta fluorescensintensiteten.

Här beskriver vi protokoll och utrustning som gör det möjligt att använda FM-färgämnen för att analysera synaptiska vesikler återvinning även i samband med svag eller ingen stimulans, i synnerhet den miniatyr synaptiska aktiviteten. Vi visar exempel på färgning och avfärgning av blåsor under framkallade och spontana synaptiska händelser, med hjälp av odlade gnagare hippocampus neuroner, och avbilda avfärgning fasen. Vi visar också hur man ska utvärdera graden av FM färgämne fotoblekning, i avsaknad av FM färgämne förlust på grund av synaptiska aktiviteter.

Protocol

1. Primär kultur av nervceller från däggdjurshjärnan Alla djurförsök som utförs i denna studie har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Iowa. Förbered dissocierade cellkultur av CA3-CA1 regionerna av hippocampus från möss eller råttor efter födelsen dagar 0-1 19,20. Plate de hippocampus celler på 12-mm täckglas (tjocklek nummer 0) förinställas med råttan gliaceller feeder lager, i 24-brunnar, och med en tä…

Representative Results

Som ett exempel visar vi representativa resultat för avfärgning tidsförloppet av synaptiska vesikler (Figur 4). Odlade hippocampusneuroner färgades med FM4-64 med användning av den spontana synaptisk aktivitet (steg 2,3) och tvättades med färgämnesfria lösningen (sköljning lösning 2). Avbildningen visar den initiala avfärgning tidsförloppet med hjälp av spontan aktivitet (steg 5,3) (första delen av kontinuerlig linje, figur 4A). Detta följs av avfärgning tidsförloppet …

Discussion

Vi har beskrivit protokoll för färgning och avfärgning synaptiska vesikler som svar på frammanat, spontan och miniatyr synaptisk aktivitet, och för avbildning under avfärgning fasen. Förutom de befintliga protokoll, har vi inkluderat ett nytt protokoll för att observera FM avfärgning utifrån miniatyr synaptisk aktivitet. Med hjälp av dessa protokoll, vi tidigare identifierat avvikelser i odlade nervceller från en musmodell av rörelsestörning dystoni. I jämförelse med sina motsvarigheter i vildtyp möss, …

Materials

Pulse generator	AMPI	Master-8
Isolated stimulator	Digitimer	DS3
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TS100	This is used for assessing the cell morphology at low magnification.
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TiE	This is used for high-resolution fluorescence and transmitted light imaging, with minimal focus drift.
Objective lens	Nikon		Water-immersion lens is recommended. Oil-immersion lens is usable unless an imaged structure is deep from the coverslip surface (e.g. >10 μm).
Filter cube	Nikon	77032509	490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em for FM1-43
Filter cube	Nikon	77032809	490/20-nm ex, 510-nm dclp, 650-nm-LP em for FM4-64.
EMCCD camera	Andor Technology	iXon EM+ DU-860	This EMCCD camera is used for high-sensitivity detection of fluorescence.
Liquid recirculating chiller	Solid State Cooling Systems	Oasis 160	This is used for continuously perfusing the camera with chilled water for maintaining a temperature of -80°C, and thereby reducing noise.
LED	CoolLED-Custom Interconnect	490 nm	This light source is used for rapid on/off control of fluorescence excitation.
Image acquisition software	Andor Technology	Solis
Imaging chamber	Warner Instruments	RC-21BRFS
Fast perfusion system	Warner Instruments	SF-77B
CNQX	Tocris Bioscience	1045
D,L-AP5	Tocris Bioscience	0106
Tetrodotoxin	Tocris Bioscience	1069	Caution: toxic reagent. Handle with care.
FM1-43	Invitrogen	T35356
Aldehyde-fixable FM1-43 (FM1-43FX)	Invitrogen	F35355
FM4-64	Invitrogen	T13320
Aldehyde-fixable FM4-64 (FM4-64FX)	Invitrogen	F34653
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I0634
Hanks’ balanced salt	Sigma-Aldrich	H2387
Minimum Essential Medium	Invitrogen	51200-038	This solution does not contain phenol red that will interfere with fluorescence imaging.
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Caution: toxic reagent. Handle with care.
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903