Aip1p动力由R256H突变的肌动蛋白蚀变
Summary
致病突变的肌动蛋白可以改变细胞骨架的功能。细胞骨架动力学是通过利用全内荧光显微镜荧光标记蛋白成像量化。作为一个例子，细胞骨架蛋白，Aip1p，已经改变了定位和运动在细胞中表达突变的肌动蛋白同种型，R256H。
Abstract
在肌动蛋白基因突变引起一系列由于特定的分子变化，往往改变细胞骨架功能的人类疾病。在这项研究中，荧光的成像标签的使用总的内部荧光（TIRF）显微镜是用于可视化和量化改变的细胞骨架动力学的蛋白质。 TIRF显微镜和使用荧光标记的也允许在肌动蛋白的突变引起的变化，细胞骨架动力学的定量。使用这种技术，在活细胞中的细胞骨架功能的定量有价值的补充在蛋白质功能的体外研究。作为一个例子，影响肌动蛋白残基R256的错义突变已经确定在3人肌动蛋白异构体表明该氨基酸起着调节的相互作用中起重要作用。利用酵母模型的骨架运动的肌动蛋白基因突变R256H的影响进行了研究。蛋白质，AIP1，这是众所周知的协助丝切蛋白在肌动蛋白解聚，是具有标记的绿色荧光蛋白（GFP）在N-末端和使用TIRF显微镜追踪体内 。 Aip1p运动的野生型和突变株的速率进行定量。在细胞中表达R256H突变的肌动蛋白，Aip1p运动被限制，并且移动速度是近一半在野生型细胞中测得（0.88±0.30微米/秒，R256H细胞相比，1.60速度±0.42微米/秒在野生型细胞中，对<0.005）。
Introduction
肌动蛋白是一种包括细胞骨架的主要蛋白质，参与关键的细胞过程，包括细胞分裂，细胞器运动，细胞运动，收缩和信令。在过去的十年中，致病突变的肌动蛋白被发现在每一个六人肌动蛋白异构体，导致一系列的疾病的，从肌病冠状动脉疾病1-7。由肌动蛋白基因突变导致疾病的进程继续阐明。酵母模型仍然是金标准，研究由于单一基本肌动蛋白异构体，遗传易处理性和高保护肌动蛋白的序列和功能的优势在肌动蛋白功能的突变的生化效应。研究表明，个体的肌动蛋白基因突变导致分子的具体功能障碍与显性负效应8。例如，在γ-非肌肉肌动蛋白耳聋致病突变影响赖氨酸-118残基通过改变调节肌动蛋白结合蛋白ARP2 / 3 9。研究经常采用体外分析蛋白质：蛋白质相互作用。调查肌动蛋白突变对细胞生物学和，特别是肌动蛋白结合蛋白定位于细胞的效果是有限的。
体内的酵母细胞骨架的研究传统上依赖于固定细胞的倒置荧光显微镜10的图像。这些实验提供了约肌动蛋白细胞骨架的形态学基础数据。调查已自掺入三维共焦成像可视化的复杂的细胞骨架网络11，12。该成像允许肌动蛋白斑块和长丝的数量和相对位置的量化。薄膜部电子断层扫描已用于图像相对于保藏的亚细胞结构13致密的丝状网络的形态。拥挤的蜂窝s步具有小的横截面中可以检查细节与此技术。成像研究已经扩展到使用时间的推移荧光显微镜活细胞。当光漂白和背景荧光可以缓和，时间的推移成像可以研究到细胞骨架蛋白的动态和应对环境条件11，14。另外， 在体外微丝的动态可视化垫付引进全内反射荧光（TIRF）显微镜。相比宽视场显微镜，TIRF具有减少背景荧光的优点和增强的对比度以监测单丝15，16。凭借这些优势，全内反射荧光显微镜已经适应了细胞生物学家监测细胞结构在质膜17，18。细胞事件，包括改变的细胞骨架，可以被可视化的实时低光毒性，最大对比度和最小的背景荧光19。
为了更好地理解对移动，本地化和营业额在细胞内，全内反射荧光显微镜和蛋白标记细胞骨架蛋白肌动蛋白基因突变的影响进行了使用。这里，方法来研究在肌动蛋白上的在酿酒酵母中的细胞骨架动力学临床相关突变的影响进行说明。具体地说，肌动蛋白结合蛋白，Aip1p的定位和移动，被可视化和量化，在细胞中表达的R256H突变的肌动蛋白。这些技术配合体外生化研究，并允许蛋白质相互作用和功能的更深入的了解。
Protocol
Representative Results
Discussion
以可视化的细胞骨架和实用程序的动态，对致病基因突变研究一种有效的策略已经在这里描述。先进的成像方式创造了新的机会，了解蛋白质在细胞内的运动靠近细胞膜。全内反射荧光显微镜（TIRF）是一种灵敏的技术用于在活细胞中的功能性研究。 TIRF使用创建由于在盖玻片和水性介质的折射率差的渐逝场的角度的激励激光器。渐逝场的能量激发荧光团，但与盖玻片和水之间的界面的距离呈指数?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢彼得·鲁宾斯坦的有益的讨论，并提供技术咨询和大卫Pellman原PB1996克隆。这项工作是由March of Dimes的赠款，并从乘驾为孩子的资金支持。
Materials
| Agarose | rpi | 9012-36-6 | |
| Bromophenol Blue | Amresco | 115-39-9 | |
| BSA | NEB | B9001S | |
| Change-IT Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis Kit | USB Corporation | 4166059 | |
| CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| DNA, single stranded from salmon testes | Sigma | 9007-49-2 | |
| EDTA pH 7.4 | Sigma | 93302 | |
| Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585-011 | Warning! Harmful irritation |
| Fungal/Bacterial DNA Kit | Symo Research | D6005 | |
| HpaI | NEB | R0105S | |
| Lithium Acetate | AlfaAesar | 6108-17-4 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10068-013 | |
| NE Buffer #4 | NEB | B7004S | |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Invitrogen | 12532-016 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | Any kit will work |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Sodium azide | Sigma | 26628-22-8 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-023 | |
| PEG | Amresco | 25322-68-3 | |
| Tris Base Ultrapure | rpi | 77-86-1 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | 1/6/2015 | |
| XhoI | NEB | R0146S | |
| XmaI | NEB | R0180S | |
| YPD media | LabExpress | 3011 | |
| -URA Media | LabExpress | 3010 | |
| PCR Machine | Invitrogen | 4359659 | Any PCR machine will work |
| TIRF Microscope | Olympus IX81 | ||
| Hamamatsu ORCA-R camera | Hamamatsu |
References
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