Aip1p Dynamics Aktin de R256H Mutasyon tarafından Altered Hazır
Summary
Aktin hastalığa neden olan mutasyonların sitoskeletal işlevini değiştirebilir. Sitoskeletal dinamikleri toplam iç floresan mikroskobu kullanarak floresan etiketli proteinlerin görüntülenmesi ile ölçülür. Bir örnek olarak, hücre iskeleti protein, Aip1p, mutant aktin izoformu, R256H ifade eden hücrelerde lokalizasyonu ve hareket değişmiş bulunmaktadır.
Abstract
Aktin mutasyonlar, sık sık hücre iskeleti işlevini değiştirebilir spesifik moleküler değişiklikleri nedeniyle insan hastalıklarının bir dizi yol açar. Bu çalışmada, Floresan görüntüleme toplam iç floresan (TIRF) mikroskopi sitoskeletal dinamikleri değişiklikleri görselleştirmek ve ölçmek için kullanılan kullanılarak proteinler etiketledi. TIRF mikroskopi ve floresan etiketleri kullanımı da aktin mutasyonların neden sitoskeletal dinamikleri değişikliklerin ölçümü sağlar. Bu teknik kullanılarak, canlı hücrelerde hücre iskeleti fonksiyonun ölçümü rıyla protein fonksiyonunun in vitro çalışmalarda tamamlar. Bir örnek olarak, aktin tortu, R256 etkileyen yanlış anlamlı mutasyonlar, bu amino asit düzenleyici etkileşimlerinde önemli bir rol oynadığı öne üç insan aktini izoformu tespit edilmiştir. Sitoskeletal hareketlere aktin mutasyon R256H etkileri maya modeli kullanılarak incelenmiştir. Aktin depolimerizasyon in cofilin yardımcı olmak için bilinen protein, Aip1, olduN-terminalinde, yeşil floresan proteini (GFP) ile etiketlendi ve TIRF mikroskopi kullanılarak in vivo takip etti. Vahşi tip ve mutant suşları hem de Aip1p hareketinin hızı ölçülmüştür. R256H mutant aktin eksprese eden hücrelerde, Aip1p hareket sınırlı ve hareketin hızı 1,60 ile karşılaştırıldığında R256H hücrelerde 0.88 ± 0.30 mm / saniye (vahşi tür hücrelerinde ölçülen yaklaşık yarısı hızda olduğunu ± 0.42 vahşi tür hücrelerinde mm / sn, p <0.005).
Introduction
Aktin hücre iskeletinin içeren dominant protein ve hücre bölünmesi, organel hareketi, hücre hareketi, kasılma, ve sinyalizasyon gibi kritik hücresel süreçleri katılır. Geçtiğimiz on yıl içinde, aktin hastalığa neden olan mutasyonlar miyopatiler koroner arter hastalığı 1-7 için, hastalıkların bir dizi yol açan altı insan aktin izoformlarının her keşfedilmiştir. Aktin mutasyonları hastalığa yol hangi süreçlerin araştırılmasına devam etmektedir. Maya modeli tek temel aktin izoformuna, genetik tractability ve aktin dizi ve fonksiyon yüksek koruma avantajları sayesinde aktin fonksiyonu üzerindeki mutasyonların biyokimyasal etkilerini incelemek için altın standart olmaya devam etmektedir. Çalışmalar bireysel aktin mutasyonları baskın olumsuz etkileri 8 ile moleküler belirli disfonksiyonlara yol olduğunu göstermektedir. Örneğin, Lys-118 artık madde etkiler γ-non-kas aktin sağırlık neden olan mutasyonlar tarafından düzenleme değiştirebiliraktin bağlayıcı protein Arp2 / 3 9. Çalışmalar sıklıkla in vitro olarak istihdam protein analiz: protein etkileşimleri. Mutasyon üzerine, hücre biyolojisi, aktin ve, özellikle de, hücre içinde bağlayıcı protein lokalizasyonu aktin etkisine araştırmalar sınırlıdır.
In vivo olarak maya hücre iskeletinin çalışmalar geleneksel bir ters flüoresan mikroskop 10 sabit hücre görüntüleri kullanır. Bu deneyler, aktin hücre iskeletinin morfolojisi hakkında temel girdi sağlamıştır. Araştırmalar bu yana karmaşık sitoskeletal ağı 11, 12, görselleştirmek için üç boyutlu konfokal görüntüleme dahil etmişlerdir. Bu görüntüleme aktin yamalar ve filamentler bolluğu ve göreli konumu kantifikasyonunu izin verir. Ince kesit elektron tomografi korunmuş hücre içi yapılarda 13 göreli olarak yoğun lifli ağların morfolojisi görüntü için kullanılmıştır. Kalabalık hücresel sküçük bir kesit ile adım bu tekniği ile ince ayrıntılı incelenebilir. Görüntüleme çalışmaları zaman atlamalı floresan mikroskopi kullanılarak canlı hücreler için uzatılmıştır. Beyazlatma fotoğraf ve arka plan floresan yönetilir olabilir zaman, zaman atlamalı görüntüleme incelemeleri sitoskeletal proteinlerin dinamikleri ve çevre koşulları 11, 14 yanıt olarak verir. Ayrı, in vitro aktin filamentler dinamikleri görselleştirme toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi tanıtımı tarafından ortaya atılmıştır. Geniş alan mikroskobu ile karşılaştırıldığında, TIRF azalmış eşiğe yararlanmak ve bireysel filamanlar 15, 16 izlemek için geliştirilmiş kontrast vardır. Bu nitelikleri ile, TIRF mikroskopi plazma zarı 17, 18, hücresel yapıları izlemek için hücre biyologlar tarafından adapte edilmiştir. Hücre iskeletinin değişiklikler dahil olmak üzere hücresel olaylar, canDüşük fototoksisite, maksimum kontrast ve en az arka plan çiçeklenme 19 gerçek zaman görünür.
Daha iyi hareket, lokalizasyonu ve hücre, TIRF mikroskopi ve protein etiketleme hücre iskeleti proteinleri ciro aktin mutasyonların etkisini anlamak için kullanılmıştır. Burada, Saccharomyces cerevisiae 'de hücre iskeleti dinamikleri üzerinde aktin klinik olarak anlamlı bir mutasyon etkilerini incelemek için yöntemler tarif edilmiştir. Özel olarak, aktin bağlayıcı proteinin, Aip1p lokalizasyonu ve hareket, görsel ve aktin R256H mutasyonu ifade eden hücrelerde ölçülmüştür. Bu teknikler vitro biyokimyasal araştırmalarda tamamlayıcı ve protein etkileşimleri ve fonksiyonları daha iyi anlaşılması için izin verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Patojenik mutasyonlara araştırmalarda iskeleti ve yarar dinamiklerini görselleştirmek için etkili bir strateji burada tarif edilmiştir. Gelişmiş görüntüleme yöntemleri, hücre zarı yakın proteinlerin hücre içi hareketini anlamak için yeni fırsatlar yaratmıştır. Toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRF) canlı hücrelerin fonksiyonel çalışmalar için hassas bir tekniktir. TIRF lamel ve sulu ortamın kırılma indeksleri arasındaki fark nedeniyle genliği azalan bir alan yaratan bir açılı …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar orijinal PB1996 klon için yararlı bir tartışma ve teknik danışmanlık için Peter Rubenstein ve David Pellman teşekkür ederim. Bu çalışma Dimes Mart hibe ve Çocuklar için Ride fon tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Agarose | rpi | 9012-36-6 | |
| Bromophenol Blue | Amresco | 115-39-9 | |
| BSA | NEB | B9001S | |
| Change-IT Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis Kit | USB Corporation | 4166059 | |
| CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| DNA, single stranded from salmon testes | Sigma | 9007-49-2 | |
| EDTA pH 7.4 | Sigma | 93302 | |
| Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585-011 | Warning! Harmful irritation |
| Fungal/Bacterial DNA Kit | Symo Research | D6005 | |
| HpaI | NEB | R0105S | |
| Lithium Acetate | AlfaAesar | 6108-17-4 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10068-013 | |
| NE Buffer #4 | NEB | B7004S | |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Invitrogen | 12532-016 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | Any kit will work |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Sodium azide | Sigma | 26628-22-8 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-023 | |
| PEG | Amresco | 25322-68-3 | |
| Tris Base Ultrapure | rpi | 77-86-1 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | 1/6/2015 | |
| XhoI | NEB | R0146S | |
| XmaI | NEB | R0180S | |
| YPD media | LabExpress | 3011 | |
| -URA Media | LabExpress | 3010 | |
| PCR Machine | Invitrogen | 4359659 | Any PCR machine will work |
| TIRF Microscope | Olympus IX81 | ||
| Hamamatsu ORCA-R camera | Hamamatsu |
References
- Lehtonen, H. J., et al. Segregation of a missense variant in enteric smooth muscle actin gamma-2 with autosomal dominant familial visceral myopathy. Gastroenterology. 143, 1482-1491 (2012).
- Matsson, H., et al. Alpha-cardiac actin mutations produce atrial septal defects. Hum Mol Genet. 17, 256-265 (2008).
- Zhu, M., et al. Mutations in the gamma-actin gene (ACTG1) are associated with dominant progressive deafness (DFNA20/26). Am J Hum Genet. 73, 1082-1091 (2003).
- Nowak, K. J., et al. Mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene in patients with actin myopathy and nemaline myopathy. Nat Genet. 23, 208-212 (1999).
- Olson, T. M., Michels, V. V., Thibodeau, S. N., Tai, Y. S., Keating, M. T. Actin mutations in dilated cardiomyopathy, a heritable form of heart failure. Science. 280, 750-752 (1998).
- Riviere, J. B., et al. De novo mutations in the actin genes ACTB and ACTG1 cause Baraitser-Winter syndrome. Nat Genet. 44, 440-444 (2012).
- Guo, D. C., et al. Mutations in smooth muscle alpha-actin (ACTA2) lead to thoracic aortic aneurysms and dissections. Nat Genet. 39, 1488-1493 (2007).
- Sparrow, J. C., et al. Muscle disease caused by mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene (ACTA1). Neuromuscul Disord. 13, 519-531 (2003).
- Kruth, K. A., Rubenstein, P. A. Two deafness-causing (DFNA20/26) actin mutations affect Arp2/3-dependent actin regulation. J Biol Chem. 287, 27217-27226 (2012).
- Amberg, D. C. Three-dimensional imaging of the yeast actin cytoskeleton through the budding cell cycle. Mol Biol Cell. 9, 3259-3262 (1998).
- Pelham, R. J., Chang, F. Role of actin polymerization and actin cables in actin-patch movement in Schizosaccharomyces pombe. Nat Cell Biol. 3, 235-244 (2001).
- Vavylonis, D., Wu, J. Q., Hao, S., O’Shaughnessy, B., Pollard, T. D. Assembly mechanism of the contractile ring for cytokinesis by fission yeast. Science. 319, 97-100 (2008).
- Bertin, A., et al. Three-dimensional ultrastructure of the septin filament network in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 23, 423-432 (2012).
- Senning, E. N., Marcus, A. H. Actin polymerization driven mitochondrial transport in mating S. cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 107, 721-725 (2010).
- Breitsprecher, D., Kiesewetter, A. K., Linkner, J., Faix, J. Analysis of actin assembly by in vitro TIRF microscopy. Methods Mol Biol. 571, 401-415 (2009).
- Popp, D., Narita, A., Iwasa, M., Maeda, Y., Robinson, R. C. Molecular mechanism of bundle formation by the bacterial actin ParM. Biochem Biophys Res Commun. 391, 1598-1603 (2010).
- Trache, A., Lim, S. M. Live cell response to mechanical stimulation studied by integrated optical and atomic force microscopy. J Vis Exp. (44), (2010).
- Spira, F., Dominguez-Escobar, J., Muller, N., Wedlich-Soldner, R. Visualization of cortex organization and dynamics in microorganisms, using total internal reflection fluorescence microscopy. J Vis Exp. (63), e3982 (2012).
- Manneville, J. B. Use of TIRF microscopy to visualize actin and microtubules in migrating cells. Methods Enzymol. 406, 520-532 (2006).
- Cook, R. K., Sheff, D. R., Rubenstein, P. A. Unusual metabolism of the yeast actin amino terminus. J Biol Chem. 266, 16825-16833 (1991).
- Feng, L., et al. Fluorescence probing of yeast actin subdomain 3/4 hydrophobic loop 262-274. Actin-actin and actin-myosin interactions in actin filaments. J Biol Chem. 272, 16829-16837 (1997).
- Lin, M. C., Galletta, B. J., Sept, D., Cooper, J. A. Overlapping and distinct functions for cofilin, coronin and Aip1 in actin dynamics in vivo. J Cell Sci. 123, 1329-1342 (2010).
- Malloy, L. E., et al. Thoracic Aortic Aneurysm (TAAD)-causing Mutation in Actin Affects Formin Regulation of Polymerization. J Biol Chem. 287, 28398-28408 (2012).
- Smyth, J. W., Shaw, R. M. Visualizing ion channel dynamics at the plasma membrane. Heart Rhythm. 5, S7-S11 (2008).
- Bhattacharya, R., et al. Recruitment of vimentin to the cell surface by beta3 integrin and plectin mediates adhesion strength. J Cell Sci. 122, 1390-1400 (2009).
- Hetheridge, C., et al. The formin FMNL3 is a cytoskeletal regulator of angiogenesis. J Cell Sci. 125, 1420-1428 (2012).
- Bergeron, S. E., et al. Allele-specific effects of thoracic aortic aneurysm and dissection alpha-smooth muscle actin mutations on actin function. J Biol Chem. 286, 11356-11369 (2011).
