Aip1p 역학은 굴지의 R256H 돌연변이에 의해 변경 있습니까
Summary
굴지의 질병을 일으키는 돌연변이는 세포 골격 기능을 변경할 수 있습니다. 골격 역학 전체 내부 형광 현미경을 사용하여 찬란 태그 단백질의 영상을 통해 정량화된다. 예를 들어, 세포 골격 단백질, Aip1p는 돌연변이 말라 이소, R256H을 발현하는 세포의 현지화 및 이동을 변경했다.
Abstract
굴지의 변이는 종종 세포 골격 기능을 변경하는 특정 분자의 변화로 인해 인간의 질병의 범위가 발생할 수 있습니다. 본 연구에서는 형광의 영상은 전체 내부 형광 (TIRF) 현미경은 세포 골격 역학의 변화를 시각화하고 정량화하는 데 사용됩니다를 사용하여 단백질을 태그. TIRF 현미경과 형광 태그의 사용은 굴지의 돌연변이에 의해 발생 골격 역학의 변화를 정량화 할 수 있습니다. 이 기술을 이용하여 살아있는 세포에서 세포 골격 함수의 정량화는 소중하게 단백질 기능의 시험 관내 연구를 보완한다. 예를 들어, 액틴 잔기 R256에 영향 과오 돌연변이는이 아미노산 규제 상호 작용에서 중요한 역할을 제안하는 세 인간 액틴 동형에서 확인되었다. 골격의 움직임에 말라의 돌연변이 R256H의 효과는 효모 모델을 이용하여 연구 하였다. 말라 해중합에 cofilin을 지원하는 것으로 알려져 있습니다 단백질, Aip1는했다N-말단에 녹색 형광 단백질 (GFP) 태그와 TIRF 현미경을 사용하여 생체 내에서 추적. 야생형과 돌연변이 균주 모두에서 Aip1p 운동의 환율을 정량 하였다. R256H 돌연변이 액틴을 발현하는 세포에서 Aip1p의 움직임은 제한과 운동의 비율은 1.60에 비해 R256H 세포에서 0.88 ± 0.30 μm의 / 초 (야생형 세포에서 측정 거의 절반의 속도입니다 ± 0.42 야생형 세포 μm의 / 초, P <0.005).
Introduction
악틴 세포 골격을 구성하는 지배적 인 단백질과 세포 분열, 세포 기관의 움직임, 세포 운동성, 수축, 및 신호 등의 중요한 세포 과정에 참여하고 있습니다. 지난 10 년간 굴지의 질병을 일으키는 돌연변이는 근육 병증에서 관상 동맥 질환 1-7로, 질환의 범위에 이르는 6 인간 말라 이소 각각 발견되었다. 말라의 돌연변이가 질병으로 이어질하는 과정은 밝혀 계속. 효모 모델은 하나의 필수 말라 이소, 유전 온순함과 굴지의 순서와 기능의 높은 보존의 장점으로 인해 굴지의 기능에 대한 변이의 생화학 적 효과를 연구하기위한 황금 표준 남아있다. 연구는 개별 말라 돌연변이가 지배적 인 부정적인 영향 8 분자의 특정 기능 장애로 이어질 것을 보여줍니다. 예를 들면,리스 – 118 잔기에 영향을 γ-비 – 근육 액틴의 난청 유발 돌연변이에 의해 규제를 변경할액틴 결합 단백질 Arp2 / 3 9. 연구 자주 체외에서 사용하는 단백질의 분석 : 단백질 상호 작용을. 세포 생물학에 돌연변이를하는 걸하고, 특히, 셀에 결합 단백질의 현지화를하는 걸의 효과에 대한 조사가 제한됩니다.
생체 내에서 효모 세포 골격의 연구는 종래 거꾸로 형광 현미경 (10)에서 고정 된 세포의 이미지에 의존하고 있습니다. 이 실험은 액틴 세포 골격의 형태에 대한 기초 자료를 제공. 조사는 이후 복잡한 세포 구조 네트워크 (11), (12)를 시각화하는 세 가지 차원 공 촛점 이미징을 통합했다. 이 영상은 말라 패치 및 필라멘트의 풍요와 상대 위치의 정량화를 허용합니다. 얇은 단면도 전자 단층 보존 세포 내 구조물 (13)에 상대적으로 조밀 사상 네트워크의 모폴로지 화상에 사용되어왔다. 붐비는 세포의작은 단면 걸음이 기술로 미세 자세히 검사 할 수 있습니다. 영상 연구는 시간 경과 형광 현미경을 사용하여 살아있는 세포에 확장되었습니다. 사진 표백 및 배경 형광이 검토 될 수있을 때, 시간 경과 영상은 조사 세포 골격 단백질의 역학 및 환경 조건 (11), (14)에 대한 응답으로 할 수 있습니다. 별도로, 체외에서 액틴 필라멘트의 역학의 시각화는 전체 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경의 도입에 의해 진행되었다. 폭 넓은 분야 현미경에 비해 TIRF는 감소 배경 형광의 장점과 개별 필라멘트 (15, 16)를 모니터링하는 향상된 명암이있다. 이러한 특성으로, TIRF 현미경 원형질막 (17, 18)에 셀룰러 구조를 모니터링하는 세포 생물학에서 적응되었다. 세포 골격의 변화를 포함하여 세포 사건, 수저 광독성, 최대한의 대비, 최소한의 배경 개화 (19)를 실시간으로 시각화 될 수있다.
더 나은 운동, 현지화, 셀, TIRF 현미경과 단백질 태그의 세포 골격 단백질의 회전율에 말라 돌연변이의 효과를 이해하기 위해 사용되었다. 여기서, 사카로 마이 세스 세레 비시에있는 골격 역학 굴지의 임상 적 돌연변이의 효과를 연구하는 방법이 설명되어 있습니다. 특히, 액틴 결합 단백질, Aip1p의 현지화 및 움직임이 가시화하고 굴지의 R256H 돌연변이를 발현하는 세포의 정량 하였다. 이 기술은 생체 외 생화학 적 연구를 보완하고 단백질 상호 작용 및 기능의 큰 이해를 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
병원성 돌연변이에 대한 연구에서 세포 골격과 유틸리티의 역학을 시각화 할 수있는 효과적인 전략은 여기에 설명되어 있습니다. 고급 영상 기법은 세포막에 가까운 단백질의 세포 내 이동을 이해하는 새로운 기회를 만들었습니다. 전반사 형광 현미경 (TIRF)는 살아있는 세포의 기능 연구를위한 중요한 기술이다. TIRF는 커버 슬립과 수성 매질의 굴절률의 차이로 인해 사라져가는 필드를 만들고 각…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 원래 PB1996 클론 유용 토론 및 기술 자문 피터 루벤스 타인 데이비드 Pellman 감사합니다. 이 작품은 천의 월에서 그랜트와 어린이를위한 라이드의 자금에 의해 지원되었다.
Materials
| Agarose | rpi | 9012-36-6 | |
| Bromophenol Blue | Amresco | 115-39-9 | |
| BSA | NEB | B9001S | |
| Change-IT Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis Kit | USB Corporation | 4166059 | |
| CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| DNA, single stranded from salmon testes | Sigma | 9007-49-2 | |
| EDTA pH 7.4 | Sigma | 93302 | |
| Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585-011 | Warning! Harmful irritation |
| Fungal/Bacterial DNA Kit | Symo Research | D6005 | |
| HpaI | NEB | R0105S | |
| Lithium Acetate | AlfaAesar | 6108-17-4 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10068-013 | |
| NE Buffer #4 | NEB | B7004S | |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Invitrogen | 12532-016 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | Any kit will work |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Sodium azide | Sigma | 26628-22-8 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-023 | |
| PEG | Amresco | 25322-68-3 | |
| Tris Base Ultrapure | rpi | 77-86-1 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | 1/6/2015 | |
| XhoI | NEB | R0146S | |
| XmaI | NEB | R0180S | |
| YPD media | LabExpress | 3011 | |
| -URA Media | LabExpress | 3010 | |
| PCR Machine | Invitrogen | 4359659 | Any PCR machine will work |
| TIRF Microscope | Olympus IX81 | ||
| Hamamatsu ORCA-R camera | Hamamatsu |
References
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