Aip1p Dinámica se alteran por la R256H Mutación de actina
Summary
Mutaciones que causan enfermedades en actina pueden alterar la función del citoesqueleto. La dinámica del citoesqueleto son cuantificados a través de imágenes de las proteínas marcadas con fluorescencia utilizando microscopía de fluorescencia total interna. Como un ejemplo, la proteína del citoesqueleto, Aip1p, ha alterado la localización y el movimiento en las células que expresan la isoforma de actina mutante, R256H.
Abstract
Las mutaciones en actina causar una variedad de enfermedades humanas debido a los cambios moleculares específicos que a menudo alteran la función del citoesqueleto. En este estudio, las imágenes de marcado con fluorescencia proteínas utilizando fluorescencia interna total (TIRF) microscopía se utiliza para visualizar y cuantificar los cambios en la dinámica del citoesqueleto. Microscopía TIRF y el uso de etiquetas fluorescentes también permite para la cuantificación de los cambios en la dinámica del citoesqueleto causadas por mutaciones en actina. Usando esta técnica, la cuantificación de la función del citoesqueleto en células vivas complementa valiosamente en estudios in vitro de función de la proteína. Como un ejemplo, las mutaciones de sentido erróneo que afectan a la actina residuo R256 se han identificado en tres isoformas de actina humanos sugieren que este aminoácido desempeña un papel importante en la regulación de las interacciones. Los efectos de la mutación R256H actina en los movimientos del citoesqueleto se estudiaron utilizando el modelo de levadura. La proteína, AIP1, que se conoce para ayudar a la cofilina en despolimerización de la actina, eraetiquetados con la proteína fluorescente verde (GFP) en el extremo N-terminal y seguimiento in vivo utilizando microscopía TIRF. La velocidad de movimiento Aip1p en tanto de tipo salvaje y cepas mutantes se cuantificó. En células que expresan actina mutante R256H, Aip1p de movimiento está restringida y la tasa de movimiento es casi la mitad de la velocidad medida en las células de tipo salvaje (0,88 ± 0,30 m / seg en células R256H en comparación con 1,60 ± 0,42 m / seg en células de tipo salvaje, p <0,005).
Introduction
La actina es la proteína dominante que comprende el citoesqueleto y participa en los procesos celulares críticos incluyendo la división celular, el movimiento de orgánulos, la motilidad celular, la contracción, y la señalización. Durante la última década, las mutaciones causantes de la enfermedad en la actina se han descubierto en cada una de las seis isoformas de actina humanos que conducen a una serie de trastornos, desde miopatías a la enfermedad arterial coronaria 1-7. Los procesos por los que las mutaciones de actina conducen a la enfermedad siguen se han dilucidado. El modelo de levadura sigue siendo el estándar de oro para estudiar los efectos bioquímicos de mutaciones en función de la actina debido a las ventajas de la isoforma única esencial actina, la tratabilidad genética y de alta conservación de secuencia de actina y la función. Los estudios demuestran que las mutaciones de actina individuales conducen a disfunciones específicas moleculares con efectos negativos dominantes 8. Por ejemplo, las mutaciones que causan la sordera en actina no muscular γ que afectan al resto de Lys-118 alteran la regulación porla proteína de unión actina Arp2 / 3 9. Los estudios emplean con frecuencia los análisis in vitro de la proteína: proteína interacciones. Las investigaciones sobre el efecto de la actina mutaciones en biología celular y, en particular, la localización de proteínas de unión de actina en la célula son limitados.
Los estudios sobre el citoesqueleto de la levadura en vivo convencionalmente se basan en imágenes de las células fijas de un microscopio de fluorescencia invertido 10. Estos experimentos proporcionan datos fundamentales acerca de la morfología del citoesqueleto de actina. Las investigaciones han incorporado desde tres dimensiones de imagen confocal para visualizar la compleja red del citoesqueleto 11, 12. Esta formación de imágenes permite la cuantificación de la abundancia y la ubicación relativa de los parches de actina y filamentos. La tomografía de electrones sección delgada se ha utilizado para la imagen de la morfología de las redes densas filamentosos relativos a las estructuras subcelulares conservados 13. S celulares Crowdedpasos con una pequeña sección transversal se pueden examinar con gran detalle con esta técnica. Los estudios de imagen se han extendido a las células vivas mediante microscopía fluorescente lapso de tiempo. Cuando blanqueo foto y la fluorescencia de fondo pueden ser moderados, imagen de lapso de tiempo permite que las investigaciones sobre la dinámica de las proteínas del citoesqueleto y la respuesta a las condiciones ambientales 11, 14. Por separado, la visualización de la dinámica de los filamentos de actina in vitro se hizo avanzar por la introducción del total de fluorescencia de reflexión interna (TIRF) microscopía. En comparación con la microscopía de campo ancho, TIRF tiene la ventaja de la disminución de la fluorescencia de fondo y mejorar el contraste para supervisar filamentos individuales 15, 16. Con estas cualidades, la microscopía TIRF ha sido adaptado por los biólogos celulares para controlar las estructuras celulares en la membrana plasmática 17, 18. Eventos celulares, incluyendo los cambios en el citoesqueleto, puedevisualizar en tiempo real con una baja fototoxicidad, contraste máximo y el mínimo de fluorescencia de fondo 19.
Para comprender mejor el efecto de las mutaciones de actina a la circulación, la localización y el volumen de negocios de proteínas del citoesqueleto de la célula, la microscopía TIRF y la proteína de etiquetado se utilizaron. En la presente memoria, se describen métodos para estudiar los efectos de una mutación clínicamente relevante en la actina en la dinámica del citoesqueleto en Saccharomyces cerevisiae. Específicamente, la localización y el movimiento de la proteína de unión a actina, Aip1p, se visualizaron y cuantificaron en células que expresan la mutación R256H en actina. Estas técnicas se complementan en los estudios bioquímicos in vitro y permiten una mayor comprensión de las interacciones de proteínas y funciones.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una estrategia eficaz para visualizar la dinámica del citoesqueleto y la utilidad en las investigaciones sobre mutaciones patógenas se ha descrito aquí. Modalidades avanzadas de imagen han creado nuevas oportunidades para comprender el movimiento intracelular de proteínas cerca de la membrana celular. Microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) es una técnica sensible para los estudios funcionales en las células vivas. TIRF utiliza un láser de excitación en ángulo que crea un campo evanesce…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Peter Rubenstein útil para el debate y el asesoramiento técnico y David Pellman para el clon PB1996 originales. Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación March of Dimes y la financiación del paseo para los niños.
Materials
| Agarose | rpi | 9012-36-6 | |
| Bromophenol Blue | Amresco | 115-39-9 | |
| BSA | NEB | B9001S | |
| Change-IT Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis Kit | USB Corporation | 4166059 | |
| CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| DNA, single stranded from salmon testes | Sigma | 9007-49-2 | |
| EDTA pH 7.4 | Sigma | 93302 | |
| Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585-011 | Warning! Harmful irritation |
| Fungal/Bacterial DNA Kit | Symo Research | D6005 | |
| HpaI | NEB | R0105S | |
| Lithium Acetate | AlfaAesar | 6108-17-4 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10068-013 | |
| NE Buffer #4 | NEB | B7004S | |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Invitrogen | 12532-016 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | Any kit will work |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Sodium azide | Sigma | 26628-22-8 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-023 | |
| PEG | Amresco | 25322-68-3 | |
| Tris Base Ultrapure | rpi | 77-86-1 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | 1/6/2015 | |
| XhoI | NEB | R0146S | |
| XmaI | NEB | R0180S | |
| YPD media | LabExpress | 3011 | |
| -URA Media | LabExpress | 3010 | |
| PCR Machine | Invitrogen | 4359659 | Any PCR machine will work |
| TIRF Microscope | Olympus IX81 | ||
| Hamamatsu ORCA-R camera | Hamamatsu |
References
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