Aip1p Dynamics são alteradas pela R256H Mutação em actina
Summary
Mutações causadoras de doenças em actina pode alterar a função do citoesqueleto. Dinâmica do citoesqueleto são quantificados através de imagens de proteínas fluorescentes marcados através de microscopia de fluorescência total de interna. Como exemplo, a proteína do citoesqueleto, Aip1p, alterou a localização e movimento em células que expressam a isoforma da actina mutante, R256H.
Abstract
Mutações em actina causar uma variedade de doenças humanas devido a alterações moleculares específicos que muitas vezes alteram a função do citoesqueleto. Neste estudo, a imagiologia por fluorescência utilizando proteínas marcadas com fluorescência interna total (TIRF) microscopia é usado para visualizar e quantificar as alterações na dinâmica do citoesqueleto. Microscopia TIRF e a utilização de marcadores fluorescentes também permite a quantificação das alterações na dinâmica do citoesqueleto causadas por mutações em actina. Usando esta técnica, a quantificação da função do citoesqueleto em células vivas complementa um valioso em estudos in vitro da função da proteína. Como um exemplo, as mutações que afectam a missense resíduo R256 actina foram identificadas três isoformas de actina em humanos, sugerindo este aminoácido desempenha um papel importante nas interacções reguladoras. Os efeitos da mutação R256H actina do citoesqueleto em movimentos foram estudadas utilizando o modelo de levedura. A proteína, AIP1, que é conhecido por auxiliar cofilina na despolimerização da actina, estavamarcado com proteína verde fluorescente (GFP) na extremidade N-terminal e rastreados in vivo utilizando microscopia TIRF. A taxa de movimento Aip1p, tanto do tipo selvagem e mutantes foi quantificada. Em células que expressam R256H actina mutante, Aip1p movimento é restringido e a velocidade do movimento é quase metade da velocidade medida em células do tipo selvagem (0,88 ± 0,30 mM / seg em células R256H em comparação com 1,60 ± 0,42 mM / seg em células de tipo selvagem, p <0,005).
Introduction
A actina é a proteína predominante, compreendendo o citoesqueleto e participa em processos celulares importantes, incluindo a divisão celular, movimento organelo, motilidade celular, a contracção, e de sinalização. Ao longo da última década, as mutações que causam doenças em actina foram descobertos em cada uma das seis isoformas de actina humanos que conduzem a uma variedade de desordens, a partir de miopatias para doença da artéria coronária 1-7. Os processos pelos quais as mutações que conduzem à doença de actina continuar a ser elucidados. O modelo de levedura continua sendo o padrão ouro para o estudo dos efeitos bioquímicos de mutações na função actina devido às vantagens da única isoforma de actina essencial, rastreabilidade genética e alta conservação de seqüência e função de actina. Estudos mostram que as mutações individuais de actina levar a disfunções específicas moleculares com efeitos negativos dominantes 8. Por exemplo, as mutações que causam surdez na actina γ não-músculo-que afetam o resíduo Lys-118 altera regulamentação pora proteína de ligação à actina Arp2 / 3 9. Estudos in vitro freqüentemente empregam análises de proteína: interações protéicas. As investigações sobre o efeito da actina mutações em biologia celular e, em particular, agindo localização da proteína de ligação na célula são limitados.
Estudos sobre o citoesqueleto de levedura in vivo convencionalmente dependem de imagens de células fixadas a partir de um microscópio de fluorescência invertido 10. Estas experiências forneceu dados fundamentais sobre a morfologia do citoesqueleto de actina. As investigações, desde então, incorporou três dimensional imagem confocal para visualizar a rede do citoesqueleto complexo 11, 12. Esta imagem permite a quantificação da abundância e localização relativa de manchas de actina e filamentos. A tomografia de electrões secção fina tem sido utilizado para a imagem da morfologia das redes filamentosas densas relativos a estruturas subcelulares conservados 13. Lotado s celularespassos com uma pequena seção transversal pode ser examinado em detalhes finos com esta técnica. Estudos de imagem foram estendidas para as células vivas por microscopia de fluorescência de lapso de tempo. Quando branqueamento foto e fluorescência de fundo pode ser moderado, lapso de tempo de imagem permite que as investigações a respeito da dinâmica de proteínas do citoesqueleto ea resposta a condições ambientais 11, 14. Separadamente, a visualização da dinâmica dos filamentos de actina in vitro foi avançada pela introdução de reflexão total interna microscopia de fluorescência (TIRF). Em comparação com a microscopia de campo amplo, TIRF tem a vantagem da diminuição da fluorescência de fundo e contraste melhorado para controlar os filamentos individuais 15, 16. Com estas características, microscopia TIRF foi adaptado por biólogos celulares para monitorizar estruturas celulares na membrana de plasma 17, 18. Eventos celulares, incluindo mudanças no citoesqueleto, podeser visualizados em tempo real, com baixa fototoxicidade, máximo contraste e fundo mínimo de fluorescência 19.
Para entender melhor o efeito de mutações de actina sobre a movimentação, localização e volume de negócios de proteínas do citoesqueleto da célula, microscopia TIRF e proteína de marcação foram utilizados. Nisto, os métodos para estudar os efeitos de uma mutação clinicamente relevante em actina sobre a dinâmica do citoesqueleto em Saccharomyces cerevisiae, são descritos. Especificamente, a localização e movimento da proteína de ligação a actina, Aip1p, foi visualizada e quantificada em células que expressam a mutação R256H em actina. Estas técnicas complementares em estudos bioquímicos in vitro e permitir uma maior compreensão das interações protéicas e funções.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uma estratégia eficaz para visualizar a dinâmica do citoesqueleto e a utilidade em investigações sobre mutações patogénicas tem sido descrito aqui. Modalidades de imagem avançadas criaram novas oportunidades para entender o movimento intracelular de proteínas, perto da membrana celular. A microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) é uma técnica sensível para estudos funcionais em células vivas. TIRF usa um laser de excitação angular que cria um campo evanescente, devido à diferença …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem Peter Rubenstein para discussão útil e assessoria técnica e David Pellman para o clone PB1996 originais. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da March of Dimes e financiamento do passeio para as crianças.
Materials
| Agarose | rpi | 9012-36-6 | |
| Bromophenol Blue | Amresco | 115-39-9 | |
| BSA | NEB | B9001S | |
| Change-IT Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis Kit | USB Corporation | 4166059 | |
| CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| DNA, single stranded from salmon testes | Sigma | 9007-49-2 | |
| EDTA pH 7.4 | Sigma | 93302 | |
| Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585-011 | Warning! Harmful irritation |
| Fungal/Bacterial DNA Kit | Symo Research | D6005 | |
| HpaI | NEB | R0105S | |
| Lithium Acetate | AlfaAesar | 6108-17-4 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10068-013 | |
| NE Buffer #4 | NEB | B7004S | |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Invitrogen | 12532-016 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | Any kit will work |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Sodium azide | Sigma | 26628-22-8 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-023 | |
| PEG | Amresco | 25322-68-3 | |
| Tris Base Ultrapure | rpi | 77-86-1 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | 1/6/2015 | |
| XhoI | NEB | R0146S | |
| XmaI | NEB | R0180S | |
| YPD media | LabExpress | 3011 | |
| -URA Media | LabExpress | 3010 | |
| PCR Machine | Invitrogen | 4359659 | Any PCR machine will work |
| TIRF Microscope | Olympus IX81 | ||
| Hamamatsu ORCA-R camera | Hamamatsu |
References
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