Aip1p Динамика изменяются по R256H мутация в актина
Summary
Болезнетворных мутаций в актина может изменить цитоскелета функцию. Цитоскелета динамика количественно через визуализации флуоресцентно меченых белков с использованием полного внутреннего флуоресцентной микроскопии. Например, белок цитоскелета, Aip1p, изменила локализацию и движение в клетках, экспрессирующих мутантный актина изоформы, R256H.
Abstract
Мутации в актина вызвать целый ряд заболеваний человека из-за специфических молекулярных изменений, которые часто изменяют цитоскелета функцию. В этом исследовании, визуализация флюоресцентно отмеченных белков с использованием полного внутреннего флуоресценции (TIRF) микроскопия используется для визуализации и количественной оценки изменений в динамике цитоскелета. TIRF микроскопии и использование флуоресцентных меток также позволяет для количественной оценки изменений в динамике цитоскелета, вызванных мутациями в актина. Используя эту технику, количественная оценка цитоскелета функции в живых клетках полноценно дополняет в пробирке исследования функции белка. В качестве примера, миссенс мутации, влияющие на актин остаток R256 были выявлены в трех человеческих актина изоформ предлагая эта аминокислота играет важную роль в регуляторных взаимодействий. Последствия актина мутаций R256H на цитоскелета движений изучались с использованием модели дрожжей. Белок, Aip1, который, как известно, чтобы помочь в кофилин актина деполимеризации, былотмеченных зеленым флуоресцентным белком (GFP) в N-конца и отслеживаются в естественных условиях с использованием TIRF микроскопии. Скорость движения Aip1p и в дикого типа и мутантных штаммов количественно. В клетках, экспрессирующих мутантный R256H актин, Aip1p движение ограничено и скорость движения составляет почти половину скорости измеряется в клетках дикого типа (0,88 ± 0,30 мкм / сек в R256H клеток по сравнению с 1,60 ± 0,42 мкм / сек в клеток дикого типа, стр. <0,005).
Introduction
Актина является доминирующим белок, содержащий цитоскелета и участвует в важных клеточных процессов, включая деление клеток, движение органелл, подвижности клеток, сокращение, и сигнализации. За последние десять лет, болезнетворные мутации в актина были обнаружены в каждом из шести человеческих актина изоформ ведущих к целому ряду нарушений, от миопатиях ишемической болезни сердца 1-7. Процессы, с помощью которого актина мутации приводят к развитию заболеваний по-прежнему выяснены. Дрожжи модель остается золотым стандартом для изучения биохимических эффектов мутаций на функцию актина за счет преимуществ одной существенной актина изоформы, генной сговорчивости и высокой сохранения последовательности актина и функции. Исследования показывают, что отдельные мутации актина привести к молекулярным конкретных нарушений с доминирующими негативными последствиями 8. Например, глухота, вызывающих мутации в γ-не-мышечной актина, которые влияют на остаток Lys-118 изменить регулирование посвязывание актина белок Arp2 / 3 9. Исследования часто используют в лабораторных анализов белка: белковых взаимодействий. Исследования эффекта актина мутации в клеточной биологии и, в частности, актин связывающий белок локализации в клетке ограничены.
Исследования дрожжей цитоскелета в естественных условиях обычно полагаются на изображениях фиксированных клеток из перевернутой флуоресцентного микроскопа 10. Эти эксперименты поставляется основополагающие данные о морфологии цитоскелета. Исследования с включены трехмерную визуализацию конфокальной визуализировать сложную цитоскелета сеть 11, 12. Это томография позволяет количественно определить изобилия и относительного расположения актина и нитей. Тонкие разделе электронной томографии был использован для изображения морфология плотных нитевидных сетей относительно сохранившихся субклеточных структур 13. Переполненные сотовые сшагов с малым сечением могут быть рассмотрены в мелких деталях с этой техникой. Исследования по визуализации были распространены на живых клетках, используя промежуток времени флуоресцентной микроскопии. Когда фото отбеливание и фоновой флуоресценции можно модерируются, изображения промежуток времени позволяет исследования как с динамикой белков цитоскелета и ответ на условия окружающей среды 11, 14. Отдельно визуализация динамики актина в пробирке была выдвинута путем введения полного внутреннего отражения флуоресценции (TIRF) микроскопия. По сравнению с широким микроскопии, TIRF имеет преимущество уменьшилось фоновой флуоресценции и повышенную контрастность для мониторинга отдельных нитей 15, 16. С этими качествами TIRF микроскопии была адаптирована клеточных биологов контролировать клеточные структуры в мембране плазмы 17, 18. Сотовые события, включая изменения в цитоскелета, можетбыть визуализированы в реальном времени с низким фототоксичности, максимальной контрастности и минимальной фоне расцвета 19.
Чтобы лучше понять влияние актина мутаций на передвижение, локализации и оборота белков цитоскелета в клетке, TIRF микроскопии и белка пометки были использованы. При этом методы для изучения влияния клинически значимых мутаций в актина на цитоскелета динамики в Saccharomyces Cerevisiae описаны. Частности, локализация и движение актина связывающего белка, Aip1p, визуализировали и количественно в клетках, экспрессирующих мутацию R256H в актина. Эти методы дополняют в пробирке биохимических исследований и позволяют большему пониманию белковых взаимодействий и функций.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эффективная стратегия для визуализации динамики цитоскелета и утилиты в исследованиях по патогенных мутаций было описано здесь. Расширенный методами визуализации создали новые возможности для понимания внутриклеточное движение белков около клеточной мембраны. Полное внутреннее о?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Питер Рубинштейн за полезные обсуждения и технических консультаций и Дэвид Pellman для оригинального PB1996 клона. Эта работа была поддержана грантом Марша Dimes и финансирования от езды для детей.
Materials
| Agarose | rpi | 9012-36-6 | |
| Bromophenol Blue | Amresco | 115-39-9 | |
| BSA | NEB | B9001S | |
| Change-IT Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis Kit | USB Corporation | 4166059 | |
| CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| DNA, single stranded from salmon testes | Sigma | 9007-49-2 | |
| EDTA pH 7.4 | Sigma | 93302 | |
| Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585-011 | Warning! Harmful irritation |
| Fungal/Bacterial DNA Kit | Symo Research | D6005 | |
| HpaI | NEB | R0105S | |
| Lithium Acetate | AlfaAesar | 6108-17-4 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10068-013 | |
| NE Buffer #4 | NEB | B7004S | |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Invitrogen | 12532-016 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | Any kit will work |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Sodium azide | Sigma | 26628-22-8 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-023 | |
| PEG | Amresco | 25322-68-3 | |
| Tris Base Ultrapure | rpi | 77-86-1 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | 1/6/2015 | |
| XhoI | NEB | R0146S | |
| XmaI | NEB | R0180S | |
| YPD media | LabExpress | 3011 | |
| -URA Media | LabExpress | 3010 | |
| PCR Machine | Invitrogen | 4359659 | Any PCR machine will work |
| TIRF Microscope | Olympus IX81 | ||
| Hamamatsu ORCA-R camera | Hamamatsu |
References
- Lehtonen, H. J., et al. Segregation of a missense variant in enteric smooth muscle actin gamma-2 with autosomal dominant familial visceral myopathy. Gastroenterology. 143, 1482-1491 (2012).
- Matsson, H., et al. Alpha-cardiac actin mutations produce atrial septal defects. Hum Mol Genet. 17, 256-265 (2008).
- Zhu, M., et al. Mutations in the gamma-actin gene (ACTG1) are associated with dominant progressive deafness (DFNA20/26). Am J Hum Genet. 73, 1082-1091 (2003).
- Nowak, K. J., et al. Mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene in patients with actin myopathy and nemaline myopathy. Nat Genet. 23, 208-212 (1999).
- Olson, T. M., Michels, V. V., Thibodeau, S. N., Tai, Y. S., Keating, M. T. Actin mutations in dilated cardiomyopathy, a heritable form of heart failure. Science. 280, 750-752 (1998).
- Riviere, J. B., et al. De novo mutations in the actin genes ACTB and ACTG1 cause Baraitser-Winter syndrome. Nat Genet. 44, 440-444 (2012).
- Guo, D. C., et al. Mutations in smooth muscle alpha-actin (ACTA2) lead to thoracic aortic aneurysms and dissections. Nat Genet. 39, 1488-1493 (2007).
- Sparrow, J. C., et al. Muscle disease caused by mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene (ACTA1). Neuromuscul Disord. 13, 519-531 (2003).
- Kruth, K. A., Rubenstein, P. A. Two deafness-causing (DFNA20/26) actin mutations affect Arp2/3-dependent actin regulation. J Biol Chem. 287, 27217-27226 (2012).
- Amberg, D. C. Three-dimensional imaging of the yeast actin cytoskeleton through the budding cell cycle. Mol Biol Cell. 9, 3259-3262 (1998).
- Pelham, R. J., Chang, F. Role of actin polymerization and actin cables in actin-patch movement in Schizosaccharomyces pombe. Nat Cell Biol. 3, 235-244 (2001).
- Vavylonis, D., Wu, J. Q., Hao, S., O’Shaughnessy, B., Pollard, T. D. Assembly mechanism of the contractile ring for cytokinesis by fission yeast. Science. 319, 97-100 (2008).
- Bertin, A., et al. Three-dimensional ultrastructure of the septin filament network in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 23, 423-432 (2012).
- Senning, E. N., Marcus, A. H. Actin polymerization driven mitochondrial transport in mating S. cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 107, 721-725 (2010).
- Breitsprecher, D., Kiesewetter, A. K., Linkner, J., Faix, J. Analysis of actin assembly by in vitro TIRF microscopy. Methods Mol Biol. 571, 401-415 (2009).
- Popp, D., Narita, A., Iwasa, M., Maeda, Y., Robinson, R. C. Molecular mechanism of bundle formation by the bacterial actin ParM. Biochem Biophys Res Commun. 391, 1598-1603 (2010).
- Trache, A., Lim, S. M. Live cell response to mechanical stimulation studied by integrated optical and atomic force microscopy. J Vis Exp. (44), (2010).
- Spira, F., Dominguez-Escobar, J., Muller, N., Wedlich-Soldner, R. Visualization of cortex organization and dynamics in microorganisms, using total internal reflection fluorescence microscopy. J Vis Exp. (63), e3982 (2012).
- Manneville, J. B. Use of TIRF microscopy to visualize actin and microtubules in migrating cells. Methods Enzymol. 406, 520-532 (2006).
- Cook, R. K., Sheff, D. R., Rubenstein, P. A. Unusual metabolism of the yeast actin amino terminus. J Biol Chem. 266, 16825-16833 (1991).
- Feng, L., et al. Fluorescence probing of yeast actin subdomain 3/4 hydrophobic loop 262-274. Actin-actin and actin-myosin interactions in actin filaments. J Biol Chem. 272, 16829-16837 (1997).
- Lin, M. C., Galletta, B. J., Sept, D., Cooper, J. A. Overlapping and distinct functions for cofilin, coronin and Aip1 in actin dynamics in vivo. J Cell Sci. 123, 1329-1342 (2010).
- Malloy, L. E., et al. Thoracic Aortic Aneurysm (TAAD)-causing Mutation in Actin Affects Formin Regulation of Polymerization. J Biol Chem. 287, 28398-28408 (2012).
- Smyth, J. W., Shaw, R. M. Visualizing ion channel dynamics at the plasma membrane. Heart Rhythm. 5, S7-S11 (2008).
- Bhattacharya, R., et al. Recruitment of vimentin to the cell surface by beta3 integrin and plectin mediates adhesion strength. J Cell Sci. 122, 1390-1400 (2009).
- Hetheridge, C., et al. The formin FMNL3 is a cytoskeletal regulator of angiogenesis. J Cell Sci. 125, 1420-1428 (2012).
- Bergeron, S. E., et al. Allele-specific effects of thoracic aortic aneurysm and dissection alpha-smooth muscle actin mutations on actin function. J Biol Chem. 286, 11356-11369 (2011).
