Aip1p Dynamics sono alterati dalla R256H mutazione in actina
Summary
Malattia mutazioni che causano in actina possono alterare la funzione del citoscheletro. Dinamica del citoscheletro vengono quantificati attraverso l'imaging di proteine con targhetta modo fluorescente utilizzando totale microscopia a fluorescenza interna. Come esempio, la proteina del citoscheletro, Aip1p, ha modificato la localizzazione e il movimento in cellule esprimenti l'isoforma actina mutante, R256H.
Abstract
Mutazioni in actina causare una serie di malattie umane dovute a cambiamenti molecolari specifici che spesso alterano la funzione del citoscheletro. In questo studio, l'imaging di fluorescenza tagged proteine mediante fluorescenza interna totale (TIRF) microscopio viene utilizzato per visualizzare e quantificare i cambiamenti nelle dinamiche del citoscheletro. Microscopia TIRF e l'uso di tag fluorescenti consente inoltre per la quantificazione dei cambiamenti nelle dinamiche del citoscheletro causata da mutazioni in actina. Usando questa tecnica, quantificazione della funzione del citoscheletro in cellule vive integra pregevolmente studi in vitro della funzione della proteina. Come esempio, mutazioni di senso influenzano il residuo actina R256 sono stati identificati in tre isoforme di actina umani suggerendo questo aminoacido svolge un ruolo importante nelle interazioni regolamentazione. Gli effetti della actina mutazione R256H sui movimenti del citoscheletro sono stati studiati utilizzando il modello di lievito. La proteina, Aip1, che è noto per assistere cofilin in actina depolimerizzazione, eraetichettati con la proteina fluorescente verde (GFP) al N-terminale e tracciati in vivo mediante microscopia TIRF. La velocità di movimento Aip1p sia wild type e mutanti è stata quantificata. Nelle cellule esprimenti mutante R256H actina, Aip1p movimento è limitata e la velocità di movimento è circa la metà della velocità misurata in cellule di tipo selvatico (0,88 ± 0,30 micron / sec in cellule R256H rispetto a 1,60 ± 0,42 micron / sec in cellule di tipo selvatico, p <0.005).
Introduction
Actina è la proteina dominante comprendente il citoscheletro e partecipa ai processi cellulari critici compresi divisione cellulare, movimento organello, la motilità cellulare, la contrazione e segnalazione. Negli ultimi dieci anni, le mutazioni che causano la malattia di actina sono stati scoperti in ciascuna delle sei isoforme di actina umani che portano a una serie di disturbi, da miopatie a malattia coronarica 1-7. I processi attraverso i quali le mutazioni di actina portano alla malattia continuano ad essere chiariti. Il modello di lievito resta il gold standard per studiare gli effetti biochimici di mutazioni sulla funzione actina causa dei vantaggi della singola isoforma actina essenziale, trattabilità genetica ed elevata conservazione di sequenza e funzione di actina. Gli studi dimostrano che le singole mutazioni di actina portano a specifiche disfunzioni molecolari con effetti negativi dominanti 8. Ad esempio, mutazioni che causano sordità in actina γ-non-muscolare che influenzano il residuo Lys-118 alterano regolamentazione da partela proteina di legame actina Arp2 / 3 9. Studi frequentemente utilizzano in vitro analisi di proteine: interazioni proteina. Indagini l'effetto di actina mutazioni in biologia cellulare e, in particolare, actina localizzazione delle proteine di legame nella cella sono limitati.
Studi del citoscheletro lievito in vivo convenzionalmente basano su immagini di cellule fissate da un microscopio invertito a fluorescenza 10. Questi esperimenti hanno fornito dati fondamentali sulla morfologia del citoscheletro actina. Le indagini hanno dato inserito tridimensionale confocale per visualizzare la complessa rete del citoscheletro 11, 12. Questa rappresentazione consente di quantificare l'abbondanza e la posizione relativa di patch di actina e filamenti. Sottile sezione tomografia elettronica è stato usato per l'immagine della morfologia delle reti filamentosi dense relativi alle strutture subcellulari conservate 13. S Crowded cellularipassi con una piccola sezione trasversale possono essere esaminate in dettaglio fine con questa tecnica. Studi di imaging sono stati estesi per le cellule viventi usando la microscopia a fluorescenza time lapse. Quando fotoindotto e fluorescenza di fondo possono essere moderato, imaging lasso di tempo permette indagini alla dinamica delle proteine citoscheletriche e la risposta alle condizioni ambientali 11, 14. Separatamente, la visualizzazione della dinamica dei filamenti di actina in vitro è stata avanzata dall'introduzione di riflessione interna totale fluorescenza (TIRF) microscopia. Rispetto alla microscopia campo ampio, TIRF ha il vantaggio di una ridotta fluorescenza di fondo e maggiore contrasto per monitorare singoli filamenti 15, 16. Con queste qualità, la microscopia TIRF è stato adattato da biologi cellulari per monitorare strutture cellulari a livello della membrana plasmatica 17, 18. Eventi cellulari, inclusi i cambiamenti nel citoscheletro, puòessere visualizzati in tempo reale con un basso fototossicità, contrasto massimo, e lo sfondo minimal fioritura 19.
Per comprendere meglio l'effetto di mutazioni actina sul movimento, localizzazione, e turnover di proteine citoscheletriche nella cellula, microscopia TIRF e proteina codifica sono stati utilizzati. Qui, sono descritti metodi per studiare gli effetti di una mutazione clinicamente rilevante sulla dinamica del citoscheletro di actina in Saccharomyces cerevisiae. Specificamente, la localizzazione e il movimento della proteina di legame actina, Aip1p, è stata visualizzata e quantificati in cellule che esprimono la mutazione R256H in actina. Queste tecniche si completano a studi biochimici in vitro e consentono una maggiore comprensione delle interazioni proteiche e funzioni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una strategia efficace per visualizzare la dinamica del citoscheletro e l'utilità nelle indagini sulle mutazioni patogene è stato descritto qui. Modalità di imaging avanzate hanno creato nuove opportunità per comprendere il movimento intracellulare di proteine nei pressi della membrana cellulare. Totale microscopia a fluorescenza di riflessione interna (TIRF) è una tecnica sensibile per studi funzionali in cellule viventi. TIRF utilizza un laser di eccitazione angolato che crea un campo evanescente a caus…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Peter Rubenstein per una discussione utile e consulenza tecnica e David Pellman per il clone PB1996 originale. Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della March of Dimes e finanziamenti dal Ride for Kids.
Materials
| Agarose | rpi | 9012-36-6 | |
| Bromophenol Blue | Amresco | 115-39-9 | |
| BSA | NEB | B9001S | |
| Change-IT Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis Kit | USB Corporation | 4166059 | |
| CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| DNA, single stranded from salmon testes | Sigma | 9007-49-2 | |
| EDTA pH 7.4 | Sigma | 93302 | |
| Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585-011 | Warning! Harmful irritation |
| Fungal/Bacterial DNA Kit | Symo Research | D6005 | |
| HpaI | NEB | R0105S | |
| Lithium Acetate | AlfaAesar | 6108-17-4 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10068-013 | |
| NE Buffer #4 | NEB | B7004S | |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Invitrogen | 12532-016 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | Any kit will work |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Sodium azide | Sigma | 26628-22-8 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-023 | |
| PEG | Amresco | 25322-68-3 | |
| Tris Base Ultrapure | rpi | 77-86-1 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | 1/6/2015 | |
| XhoI | NEB | R0146S | |
| XmaI | NEB | R0180S | |
| YPD media | LabExpress | 3011 | |
| -URA Media | LabExpress | 3010 | |
| PCR Machine | Invitrogen | 4359659 | Any PCR machine will work |
| TIRF Microscope | Olympus IX81 | ||
| Hamamatsu ORCA-R camera | Hamamatsu |
References
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