Aip1pダイナミクスはアクチンにおけるR256H変異によって変更される
Summary
アクチンにおける疾患の原因となる変異は、細胞骨格の機能を変更することができます。細胞骨格の動力学は、全内部蛍光顕微鏡を用いて蛍光タグ化タンパク質の画像化を介して定量化される。一例として、細胞骨格タンパク質、Aip1pは、変異アクチンアイソフォーム、R256Hを発現する細胞に局在化および運動を変更した。
Abstract
アクチンの変異は、多くの場合、細胞骨格の機能を変更する特定の分子変化によるヒト疾患の範囲を引き起こす。本研究では、全内部蛍光を用いて、蛍光タグ化タンパク質のイメージングは（TIRF）顕微鏡法は、細胞骨格の力学の変化を視覚化し、定量化するために使用される。 TIRF顕微鏡および蛍光タグの使用はまた、アクチンの突然変異によって引き起こされる細胞骨格の力学の変化の定量化を可能にする。この技術を用いて、生細胞中の細胞骨格機能の定量化は、常に時代のタンパク質機能のインビトロ研究で補完する。一例として、アクチン残基R256に影響するミスセンス変異は、このアミノ酸は、相互作用の調節に重要な役割を果たしている示唆して3つのヒトアクチンアイソフォームが同定されている。細胞骨格アクチンの運動に突然変異R256Hの効果は酵母モデルを用いて検討した。アクチン脱重合にコフィリンを補助することが知られているタンパク質、AIP1があったN-末端緑色蛍光タンパク質（GFP）で標識しTIRF顕微鏡法を用いてインビボで追跡した。野生型および変異株の両方でAip1pの移動速度を定量化した。 R256H変異型アクチンを発現する細胞では、Aip1p運動は制限され、移動速度が1.60に比べR256H細胞で0.88±0.30ミクロン/秒（野生型細胞で測定されたほぼ半分の速度では±0.42、野生型細胞ではミクロン/秒、P <0.005）。
Introduction
アクチンは細胞骨格を構成する支配的なタンパク質であり、細胞分裂、細胞小器官の動き、細胞の運動性、収縮、およびシグナリングを含む重要な細胞プロセスに参加しています。過去10年間で、アクチンにおける疾患の原因となる変異は、筋障害の冠動脈疾患1-7に、障害の範囲につながる6ヒトアクチンアイソフォームの各々で発見されました。アクチン変異が疾患につながるそれによってプロセスが解明され続けています。酵母モデルは、単一の本質的なアクチンアイソフォーム、遺伝従順とアクチン配列及び機能の高い保存性の利点により、アクチン機能の変異の生化学的効果を研究するためのゴールドスタンダードのまま。研究では、個々のアクチン変異がドミナントネガティブ効果8との分子の特定の機能不全につながることを示している。たとえば、のLys-118残基に影響を与え、γ-非筋アクチンにおける難聴の原因となる変異はによって規制を変えるアクチン結合タンパク質ARP2 / 3 9。研究は、しばしば、インビトロで用いるタンパク質の分析：タンパク質相互作用。細胞中のタンパク質の局在化結合細胞生物学上のアクチン変異の効果の調査、特に、アクチンは限られている。
生体内での酵母細胞骨格の研究では、従来、倒立蛍光顕微鏡10からの固定された細胞の画像に依存しています。これらの実験は、アクチン細胞骨格の形態学についての基礎的なデータを提供しました。調査は複雑なので、細胞骨格網11,12を可視化する三次元共焦点イメージングを組み込んでいる。この撮影は、豊かさとアクチンパッチやフィラメントの相対的な位置の定量化を可能にします。薄いセクションの電子線トモグラフィーは保存細胞内構造13と比較して密な線維状のネットワークの形態画像に使用されてきた。混雑した携帯S小断面のペースは、この技術を用いて微粒子を詳細に調べることができる。イメージング研究は、タイムラプス蛍光顕微鏡を用いて生細胞に拡張されている。光退色およびバックグラウンド蛍光を緩和することができる場合には、タイムラプスイメージングは、細胞骨格タンパク質の動力学および環境条件11,14に対する応答として調べることができる。これとは別に、 インビトロでのアクチンフィラメントのダイナミクスの可視化は、全内部反射蛍光（TIRF）顕微鏡法を導入することにより進めた。広視野顕微鏡法と比較して、TIRFが減少バックグラウンド蛍光と個々のフィラメント15,16を監視するための造影という利点を有する。これらの特性により、TIRF顕微鏡法は、原形質膜17,18で細胞構造を監視するために、細胞生物学者によって適合されている。細胞骨格の変化を含む細胞事象、、することができます低光毒性、最大コントラスト、最小のバックグラウンド蛍光19でリアルタイムに可視化すること。
より良いセル、全反射顕微鏡およびタンパク質のタグ付けに動き、ローカリゼーション、および細胞骨格タンパク質のターンオーバーにアクチン変異の影響を理解するために使用された。ここで、 サッカロミセス·セレビシエにおける細胞骨格アクチン動態における臨床的に関連する突然変異の効果を研究するための方法が記載されている。具体的には、アクチン結合タンパク質、Aip1pの局在化および運動は、アクチンにおけるR256H変異を発現する細胞中で可視化し、定量した。これらの技術は、in vitro生化学的研究で補完し、タンパク質相互作用や機能をより深く理解することを可能にする。
Protocol
Representative Results
Discussion
病原性の変異による検査において細胞骨格と実用性のダイナミクスを可視化するための効果的な戦略は、ここに記載されている。高度な画像診断法は、細胞膜の近くにタンパク質の細胞内の動きを理解するための新しい機会を作成しました。全反射蛍光顕微鏡（TIRF）は、生きた細胞内の機能研究のための高感度の技法である。 TIRFはカバーガラスと、水性媒体の屈折率の差によるエバネッセ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、元PB1996クローンするための有用な議論と技術的なアドバイスのためのピーター·ルーベンスタイン、デビッドPellmanに感謝します。この作品は、ダイムの月からの助成金や子供のためのライドからの資金によって支えられている。
Materials
| Agarose | rpi | 9012-36-6 | |
| Bromophenol Blue | Amresco | 115-39-9 | |
| BSA | NEB | B9001S | |
| Change-IT Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis Kit | USB Corporation | 4166059 | |
| CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| DNA, single stranded from salmon testes | Sigma | 9007-49-2 | |
| EDTA pH 7.4 | Sigma | 93302 | |
| Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585-011 | Warning! Harmful irritation |
| Fungal/Bacterial DNA Kit | Symo Research | D6005 | |
| HpaI | NEB | R0105S | |
| Lithium Acetate | AlfaAesar | 6108-17-4 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10068-013 | |
| NE Buffer #4 | NEB | B7004S | |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Invitrogen | 12532-016 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | Any kit will work |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Sodium azide | Sigma | 26628-22-8 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-023 | |
| PEG | Amresco | 25322-68-3 | |
| Tris Base Ultrapure | rpi | 77-86-1 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | 1/6/2015 | |
| XhoI | NEB | R0146S | |
| XmaI | NEB | R0180S | |
| YPD media | LabExpress | 3011 | |
| -URA Media | LabExpress | 3010 | |
| PCR Machine | Invitrogen | 4359659 | Any PCR machine will work |
| TIRF Microscope | Olympus IX81 | ||
| Hamamatsu ORCA-R camera | Hamamatsu |
References
- Lehtonen, H. J., et al. Segregation of a missense variant in enteric smooth muscle actin gamma-2 with autosomal dominant familial visceral myopathy. Gastroenterology. 143, 1482-1491 (2012).
- Matsson, H., et al. Alpha-cardiac actin mutations produce atrial septal defects. Hum Mol Genet. 17, 256-265 (2008).
- Zhu, M., et al. Mutations in the gamma-actin gene (ACTG1) are associated with dominant progressive deafness (DFNA20/26). Am J Hum Genet. 73, 1082-1091 (2003).
- Nowak, K. J., et al. Mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene in patients with actin myopathy and nemaline myopathy. Nat Genet. 23, 208-212 (1999).
- Olson, T. M., Michels, V. V., Thibodeau, S. N., Tai, Y. S., Keating, M. T. Actin mutations in dilated cardiomyopathy, a heritable form of heart failure. Science. 280, 750-752 (1998).
- Riviere, J. B., et al. De novo mutations in the actin genes ACTB and ACTG1 cause Baraitser-Winter syndrome. Nat Genet. 44, 440-444 (2012).
- Guo, D. C., et al. Mutations in smooth muscle alpha-actin (ACTA2) lead to thoracic aortic aneurysms and dissections. Nat Genet. 39, 1488-1493 (2007).
- Sparrow, J. C., et al. Muscle disease caused by mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene (ACTA1). Neuromuscul Disord. 13, 519-531 (2003).
- Kruth, K. A., Rubenstein, P. A. Two deafness-causing (DFNA20/26) actin mutations affect Arp2/3-dependent actin regulation. J Biol Chem. 287, 27217-27226 (2012).
- Amberg, D. C. Three-dimensional imaging of the yeast actin cytoskeleton through the budding cell cycle. Mol Biol Cell. 9, 3259-3262 (1998).
- Pelham, R. J., Chang, F. Role of actin polymerization and actin cables in actin-patch movement in Schizosaccharomyces pombe. Nat Cell Biol. 3, 235-244 (2001).
- Vavylonis, D., Wu, J. Q., Hao, S., O’Shaughnessy, B., Pollard, T. D. Assembly mechanism of the contractile ring for cytokinesis by fission yeast. Science. 319, 97-100 (2008).
- Bertin, A., et al. Three-dimensional ultrastructure of the septin filament network in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 23, 423-432 (2012).
- Senning, E. N., Marcus, A. H. Actin polymerization driven mitochondrial transport in mating S. cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 107, 721-725 (2010).
- Breitsprecher, D., Kiesewetter, A. K., Linkner, J., Faix, J. Analysis of actin assembly by in vitro TIRF microscopy. Methods Mol Biol. 571, 401-415 (2009).
- Popp, D., Narita, A., Iwasa, M., Maeda, Y., Robinson, R. C. Molecular mechanism of bundle formation by the bacterial actin ParM. Biochem Biophys Res Commun. 391, 1598-1603 (2010).
- Trache, A., Lim, S. M. Live cell response to mechanical stimulation studied by integrated optical and atomic force microscopy. J Vis Exp. (44), (2010).
- Spira, F., Dominguez-Escobar, J., Muller, N., Wedlich-Soldner, R. Visualization of cortex organization and dynamics in microorganisms, using total internal reflection fluorescence microscopy. J Vis Exp. (63), e3982 (2012).
- Manneville, J. B. Use of TIRF microscopy to visualize actin and microtubules in migrating cells. Methods Enzymol. 406, 520-532 (2006).
- Cook, R. K., Sheff, D. R., Rubenstein, P. A. Unusual metabolism of the yeast actin amino terminus. J Biol Chem. 266, 16825-16833 (1991).
- Feng, L., et al. Fluorescence probing of yeast actin subdomain 3/4 hydrophobic loop 262-274. Actin-actin and actin-myosin interactions in actin filaments. J Biol Chem. 272, 16829-16837 (1997).
- Lin, M. C., Galletta, B. J., Sept, D., Cooper, J. A. Overlapping and distinct functions for cofilin, coronin and Aip1 in actin dynamics in vivo. J Cell Sci. 123, 1329-1342 (2010).
- Malloy, L. E., et al. Thoracic Aortic Aneurysm (TAAD)-causing Mutation in Actin Affects Formin Regulation of Polymerization. J Biol Chem. 287, 28398-28408 (2012).
- Smyth, J. W., Shaw, R. M. Visualizing ion channel dynamics at the plasma membrane. Heart Rhythm. 5, S7-S11 (2008).
- Bhattacharya, R., et al. Recruitment of vimentin to the cell surface by beta3 integrin and plectin mediates adhesion strength. J Cell Sci. 122, 1390-1400 (2009).
- Hetheridge, C., et al. The formin FMNL3 is a cytoskeletal regulator of angiogenesis. J Cell Sci. 125, 1420-1428 (2012).
- Bergeron, S. E., et al. Allele-specific effects of thoracic aortic aneurysm and dissection alpha-smooth muscle actin mutations on actin function. J Biol Chem. 286, 11356-11369 (2011).
