Aip1p डायनेमिक्स एक्टिन में R256H उत्परिवर्तन से बदल रहे हैं
Summary
Actin में रोग के कारण म्यूटेशन cytoskeletal समारोह को बदल सकते हैं. Cytoskeletal गतिशीलता कुल आंतरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग fluorescently टैग प्रोटीन की इमेजिंग के माध्यम से मात्रा निर्धारित कर रहे हैं. एक उदाहरण के रूप में, cytoskeletal प्रोटीन, Aip1p, उत्परिवर्ती actin isoform, R256H व्यक्त कोशिकाओं में स्थानीयकरण और आंदोलन को बदल दिया है.
Abstract
Actin में उत्परिवर्तन अक्सर cytoskeletal समारोह को बदल कि विशिष्ट आणविक परिवर्तन के कारण मानव रोगों की एक सीमा के कारण. इस अध्ययन में, fluorescently की इमेजिंग कुल आंतरिक प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी cytoskeletal गतिशीलता में परिवर्तन कल्पना और यों के लिए प्रयोग किया जाता है का उपयोग टैग प्रोटीन. TIRF माइक्रोस्कोपी और फ्लोरोसेंट टैग का उपयोग भी actin में परिवर्तन की वजह से cytoskeletal गतिशीलता में परिवर्तन की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है. इस तकनीक का उपयोग करना, जीवित कोशिकाओं में cytoskeletal समारोह की मात्रा का ठहराव valuably प्रोटीन समारोह की इन विट्रो अध्ययन में पूरक. एक उदाहरण के रूप में, actin के अवशेषों R256 प्रभावित करने missense म्यूटेशनों इस अमीनो एसिड विनियामक बातचीत में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, सुझाव तीन मानव actin isoforms में पहचान की गई है. cytoskeletal आंदोलनों पर actin उत्परिवर्तन R256H के प्रभाव खमीर मॉडल का उपयोग कर अध्ययन किया गया. actin depolymerization में cofilin की सहायता के लिए जाना जाता है जो प्रोटीन, Aip1 था,एन टर्मिनस पर हरे रंग का फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के साथ टैग और TIRF माइक्रोस्कोपी का उपयोग vivo में लगाया है. जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती उपभेदों दोनों में Aip1p आंदोलन की दर मात्रा निर्धारित किया गया था. R256H उत्परिवर्ती actin व्यक्त कोशिकाओं में, Aip1p गति प्रतिबंधित और आंदोलन की दर 1.60 की तुलना में R256H कोशिकाओं में 0.88 ± 0.30 माइक्रोन / सेक (जंगली प्रकार की कोशिकाओं में मापा लगभग आधा गति है ± 0.42 जंगली प्रकार की कोशिकाओं में माइक्रोन / सेक, पी <0.005).
Introduction
Actin cytoskeleton जिसमें प्रमुख प्रोटीन होता है और कोशिका विभाजन, organelle आंदोलन, सेल गतिशीलता, संकुचन, और संकेतन सहित महत्वपूर्ण सेलुलर प्रक्रियाओं में भाग लेता है. पिछले दशक के दौरान, actin में रोग के कारण म्यूटेशन myopathies से कोरोनरी धमनी की बीमारी 1-7 करने के लिए, विकारों की एक सीमा के लिए अग्रणी छह मानव actin isoforms में से प्रत्येक में खोज की गई है. actin म्यूटेशन रोग को जन्म दे प्रक्रिया है जिसके द्वारा elucidated किया जाना जारी है. खमीर मॉडल एकल आवश्यक actin isoform, आनुवंशिक शिक्षणीयता और actin अनुक्रम और समारोह के उच्च संरक्षण के फायदे के कारण actin समारोह पर म्यूटेशन की जैव रासायनिक प्रभाव का अध्ययन करने के लिए सोने के मानक बनी हुई है. अध्ययन व्यक्तिगत actin म्यूटेशन प्रमुख नकारात्मक प्रभाव 8 के साथ आणविक विशिष्ट रोग के लिए नेतृत्व करता है. उदाहरण के लिए, लिस-118 अवशेषों को प्रभावित करने वाले γ-गैर पेशी actin में बहरापन परिवर्तन के कारण द्वारा विनियमन में परिवर्तनactin बाध्यकारी प्रोटीन Arp2 / 3 9. अध्ययन अक्सर इन विट्रो में रोजगार प्रोटीन का विश्लेषण करती है: प्रोटीन बातचीत. कोशिका जीव विज्ञान पर म्यूटेशन actin और, विशेष रूप से, सेल में बाध्यकारी प्रोटीन स्थानीयकरण actin के प्रभाव की जांच सीमित कर रहे हैं.
Vivo में खमीर cytoskeleton के अध्ययन पारंपरिक एक औंधा प्रतिदीप्ति खुर्दबीन 10 से तय कोशिकाओं की छवियों पर भरोसा करते हैं. इन प्रयोगों actin cytoskeleton की आकृति विज्ञान के बारे में आधारभूत डेटा की आपूर्ति की. जांच के बाद जटिल cytoskeletal नेटवर्क 11, 12 कल्पना करने के लिए तीन आयामी confocal इमेजिंग शामिल किया है. यह इमेजिंग actin पैच और तंतुओं की बहुतायत और सापेक्ष स्थान की मात्रा का ठहराव परमिट. पतली धारा इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी संरक्षित subcellular संरचनाओं 13 के सापेक्ष घने filamentous नेटवर्क की आकारिकी छवि के लिए इस्तेमाल किया गया है. भीड़ सेलुलर हैएक छोटे पार अनुभाग के साथ ज्ञान प्राप्त किया है कि इस तकनीक के साथ ठीक विस्तार से जांच की जा सकती है. इमेजिंग अध्ययन समय व्यतीत फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कोशिकाओं को जीवित करने के लिए बढ़ा दिया गया है. तस्वीर विरंजन और पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति संचालित किया जा सकता है, समय चूक इमेजिंग जांच cytoskeletal प्रोटीन की गतिशीलता और पर्यावरण की स्थिति में 11, 14 के जवाब के रूप में देता है. उधर, इन विट्रो में actin filaments की गतिशीलता के दृश्य के कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी के लागू होने से उन्नत किया गया था. विस्तृत क्षेत्र माइक्रोस्कोपी की तुलना में, TIRF कमी आई पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति का लाभ और व्यक्तिगत filaments 15, 16 पर नजर रखने के लिए बढ़ाया विपरीत है. इन गुणों के साथ, TIRF माइक्रोस्कोपी प्लाज्मा झिल्ली 17, 18 में सेलुलर संरचनाओं की निगरानी के लिए सेल जीव द्वारा रूपांतरित किया गया है. Cytoskeleton में परिवर्तन सहित सेलुलर घटनाओं, कर सकते हैं,कम phototoxicity, अधिक से अधिक इसके विपरीत, और न्यूनतम पृष्ठभूमि पुष्पन 19 के साथ वास्तविक समय देखे जा.
बेहतर आंदोलन, स्थानीयकरण, और सेल, TIRF माइक्रोस्कोपी और प्रोटीन टैगिंग में cytoskeletal प्रोटीन के कारोबार पर actin परिवर्तन के प्रभाव को समझने के लिए इस्तेमाल किया गया. इस के साथ साथ, Saccharomyces cerevisiae में cytoskeletal गतिशीलता पर actin में एक चिकित्सकीय प्रासंगिक उत्परिवर्तन के प्रभाव का अध्ययन करने के तरीकों से वर्णित हैं. विशेष रूप से, actin बाध्यकारी प्रोटीन, Aip1p का स्थानीयकरण और आंदोलन, कल्पना और actin में R256H उत्परिवर्तन व्यक्त कोशिकाओं में मात्रा निर्धारित किया गया था. इन तकनीकों में इन विट्रो जैव रासायनिक अध्ययन में पूरक और प्रोटीन बातचीत और कार्यों का एक बड़ा समझ के लिए अनुमति देते हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
रोगजनक म्यूटेशनों पर जांच में cytoskeleton और उपयोगिता की गतिशीलता कल्पना करने के लिए एक प्रभावी रणनीति यहाँ वर्णित किया गया है. उन्नत इमेजिंग रूपात्मकता कोशिका झिल्ली के पास प्रोटीन के intracellular आंदोलन को समझने…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों मूल PB1996 क्लोन के लिए उपयोगी चर्चा और तकनीकी सलाह के लिए पीटर Rubenstein और डेविड Pellman धन्यवाद. यह काम एक मार्च ऑफ डाइम्स से अनुदान और बच्चों के लिए सवारी से धन के द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Agarose | rpi | 9012-36-6 | |
| Bromophenol Blue | Amresco | 115-39-9 | |
| BSA | NEB | B9001S | |
| Change-IT Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis Kit | USB Corporation | 4166059 | |
| CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| DNA, single stranded from salmon testes | Sigma | 9007-49-2 | |
| EDTA pH 7.4 | Sigma | 93302 | |
| Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585-011 | Warning! Harmful irritation |
| Fungal/Bacterial DNA Kit | Symo Research | D6005 | |
| HpaI | NEB | R0105S | |
| Lithium Acetate | AlfaAesar | 6108-17-4 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10068-013 | |
| NE Buffer #4 | NEB | B7004S | |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Invitrogen | 12532-016 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | Any kit will work |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Sodium azide | Sigma | 26628-22-8 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-023 | |
| PEG | Amresco | 25322-68-3 | |
| Tris Base Ultrapure | rpi | 77-86-1 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | 1/6/2015 | |
| XhoI | NEB | R0146S | |
| XmaI | NEB | R0180S | |
| YPD media | LabExpress | 3011 | |
| -URA Media | LabExpress | 3010 | |
| PCR Machine | Invitrogen | 4359659 | Any PCR machine will work |
| TIRF Microscope | Olympus IX81 | ||
| Hamamatsu ORCA-R camera | Hamamatsu |
References
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