Aip1p Dynamics er endret av R256H Mutasjon i Actin
Summary
Sykdomsfremkallende mutasjoner i aktin kan endre cytoskeletal funksjon. Cytoskeletal dynamikk kvantifiseres gjennom avbildning av fluorescently merkede proteiner ved hjelp av total intern fluorescens mikroskopi. Som et eksempel har cytoskeletal protein, Aip1p, endret lokalisering og bevegelse i cellene som uttrykker mutant aktin isoform, R256H.
Abstract
Mutasjoner i aktin forårsake en rekke menneskelige sykdommer som skyldes spesifikke molekylære forandringer som ofte endrer cytoskeletal funksjon. I denne studien, avbildning av fluorescently tagget proteiner ved hjelp av total intern fluorescens (TIRF) mikroskopi brukes til å visualisere og kvantifisere endringer i cytoskeletal dynamikk. TIRF mikroskopi og ved bruk av fluorescerende koder gir også mulighet for kvantifisering av endringer i cytoskeletal dynamikk skyldes mutasjoner i aktin. Ved hjelp av denne teknikken, kvantifisering av cytoskeletal funksjon i levende celler valuably utfyller in vitro studier av protein funksjon. Som et eksempel, har missense mutasjoner som påvirker aktin residuum R256 blitt identifisert i tre humane aktin-isoformer som tyder på denne aminosyre spiller en viktig rolle i regulerings interaksjoner. Effektene av aktin mutasjon R256H på cytoskeletal bevegelser ble undersøkt ved hjelp av gjær modell. Proteinet, Aip1, som er kjent for å bistå cofilin i aktin depolymerisering, varmerket med grønt fluorescerende protein (GFP) ved N-terminus og sporet in vivo ved hjelp av TIRF mikroskopi. Frekvensen av Aip1p bevegelse i både villtype-og mutante stammer ble kvantifisert. I celler som uttrykker R256H mutant aktin, er Aip1p bevegelse begrenset og frekvensen av bevegelsen er nesten halvparten av hastigheten målt i vill type celler (0.88 ± 0.30 mikrometer / sek i R256H celler sammenlignet med 1,60 ± 0,42 mikrometer / sek i villtype celler, p <0.005).
Introduction
Actin er den dominerende protein bestående cytoskjelettet og deltar i kritiske cellulære prosesser, inkludert celledeling, organelle bevegelse, cellemotilitet, sammentrekning, og signalering. I løpet av det siste tiåret, har sykdomsfremkallende mutasjoner i aktin blitt oppdaget i hver av de seks menneskelige aktin isoformer som fører til en rekke lidelser, fra myopatier til koronarsykdom 1-7. De prosesser som aktin mutasjoner fører til sykdom fortsatt ikke klarlagt. Gjær modellen forblir gullstandarden for å studere de biokjemiske virkningene av mutasjoner på aktin-funksjon på grunn av fordelene med den eneste essensielle aktin isoform, genetisk tractability og høy konservering av aktin-sekvens og funksjon. Studier viser at enkelte aktin mutasjoner føre til molekylære spesifikke dysfunksjoner med dominerende negative effekter åtte. For eksempel, døvhet fremkallende mutasjoner i γ-ikke-muskel aktin som påvirker Lys-118 rester endre reguleringen avaktin bindende protein Arp2 / 3 9. Studier ofte ansette in vitro analyser av protein: protein interaksjoner. Undersøkelser i virkningen av aktin mutasjoner på cellebiologi og, spesielt, aktin bindende protein lokalisering i cellen er begrenset.
Studier av gjæren cytoskjelettet in vivo konvensjonelt avhengige bilde av anleggs celler fra en invertert fluorescensmikroskop 10.. Disse eksperimentene leveres grunndata om morfologi av aktin cytoskjelettet. Undersøkelser har siden innlemmet tredimensjonal confocal imaging å visualisere komplekse cytoskeletal nettverk 11, 12. Dette bildebehandling tillater kvantifisering av overflod og relative plasseringen av aktin patcher og filamenter. Tynn-delen elektron-tomografi er blitt brukt til å avbilde morfologien til de tette trådformede nett i forhold til konserverte subcellulære strukturer 13. Crowded cellulære sskritt med et lite tverrsnitt kan undersøkes i fine detaljer med denne teknikken. Imaging studier har blitt utvidet til levende celler ved hjelp av tidsinnstilte fluorescerende mikroskopi. Når foto bleking og bakgrunnsfluoresens kan bli moderert, gir tid lapse avbildning undersøkelser som til dynamikken i cytoskeletal proteiner og responsen på miljøforhold 11, 14. Hver for visualisering av dynamikken i aktin filamenter in vitro ble ført ved innføringen av total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi. Sammenlignet med bredt felt mikroskopi, har TIRF fordelen av redusert bakgrunnsfluorescens og forbedret kontrast til overvåking av de enkelte filamenter 15, 16. Med disse kvalitetene, har TIRF mikros blitt bearbeidet av cellebiologer å overvåke cellulære strukturer på plasma membran 17, 18. Cellulære hendelser, herunder endringer i cytoskjelettet, kanvisualiseres sanntid med lav fototoksisitet, maksimal kontrast og minimal bakgrunns florescence 19.
For bedre å forstå virkningen av aktin mutasjoner på bevegelsen, lokalisering, og omsetning av cytoskeletal proteiner i cellen, TIRF mikroskopi og protein merking ble anvendt. Heri beskrives det metoder for å studere virkningene av en klinisk relevant mutasjon i aktin i cytoskeletal dynamikk i Saccharomyces cerevisiae er beskrevet. Nærmere bestemt lokalisering og bevegelse av den aktin-bindende protein, Aip1p, ble visualisert og kvantifisert i celler som uttrykker R256H mutasjon i aktin. Disse teknikkene utfyller in vitro biokjemiske studier og gi rom for en større forståelse av protein interaksjoner og funksjoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
En effektiv strategi for å visualisere dynamikken i cytoskjelettet og nytten i undersøkelser om sykdomsfremkallende mutasjoner har blitt beskrevet her. Avansert bildediagnostikk har skapt nye muligheter for å forstå den intracellulære bevegelse av proteiner nær cellemembranen. Total indre refleksjon fluorescensmikroskopi (TIRF) er en følsom teknikk for funksjonelle studier i levende celler. TIRF benytter en vinklet eksitasjon laser som skaper en flyktig felt på grunn av forskjellen i brytningsindekser av dekkgla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Peter Rubenstein for nyttig diskusjon og teknisk rådgivning og David Pellman for den opprinnelige PB1996 klone. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra March of Dimes og finansiering fra Ride for Kids.
Materials
| Agarose | rpi | 9012-36-6 | |
| Bromophenol Blue | Amresco | 115-39-9 | |
| BSA | NEB | B9001S | |
| Change-IT Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis Kit | USB Corporation | 4166059 | |
| CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| DNA, single stranded from salmon testes | Sigma | 9007-49-2 | |
| EDTA pH 7.4 | Sigma | 93302 | |
| Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585-011 | Warning! Harmful irritation |
| Fungal/Bacterial DNA Kit | Symo Research | D6005 | |
| HpaI | NEB | R0105S | |
| Lithium Acetate | AlfaAesar | 6108-17-4 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10068-013 | |
| NE Buffer #4 | NEB | B7004S | |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Invitrogen | 12532-016 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | Any kit will work |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Sodium azide | Sigma | 26628-22-8 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-023 | |
| PEG | Amresco | 25322-68-3 | |
| Tris Base Ultrapure | rpi | 77-86-1 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | 1/6/2015 | |
| XhoI | NEB | R0146S | |
| XmaI | NEB | R0180S | |
| YPD media | LabExpress | 3011 | |
| -URA Media | LabExpress | 3010 | |
| PCR Machine | Invitrogen | 4359659 | Any PCR machine will work |
| TIRF Microscope | Olympus IX81 | ||
| Hamamatsu ORCA-R camera | Hamamatsu |
References
- Lehtonen, H. J., et al. Segregation of a missense variant in enteric smooth muscle actin gamma-2 with autosomal dominant familial visceral myopathy. Gastroenterology. 143, 1482-1491 (2012).
- Matsson, H., et al. Alpha-cardiac actin mutations produce atrial septal defects. Hum Mol Genet. 17, 256-265 (2008).
- Zhu, M., et al. Mutations in the gamma-actin gene (ACTG1) are associated with dominant progressive deafness (DFNA20/26). Am J Hum Genet. 73, 1082-1091 (2003).
- Nowak, K. J., et al. Mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene in patients with actin myopathy and nemaline myopathy. Nat Genet. 23, 208-212 (1999).
- Olson, T. M., Michels, V. V., Thibodeau, S. N., Tai, Y. S., Keating, M. T. Actin mutations in dilated cardiomyopathy, a heritable form of heart failure. Science. 280, 750-752 (1998).
- Riviere, J. B., et al. De novo mutations in the actin genes ACTB and ACTG1 cause Baraitser-Winter syndrome. Nat Genet. 44, 440-444 (2012).
- Guo, D. C., et al. Mutations in smooth muscle alpha-actin (ACTA2) lead to thoracic aortic aneurysms and dissections. Nat Genet. 39, 1488-1493 (2007).
- Sparrow, J. C., et al. Muscle disease caused by mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene (ACTA1). Neuromuscul Disord. 13, 519-531 (2003).
- Kruth, K. A., Rubenstein, P. A. Two deafness-causing (DFNA20/26) actin mutations affect Arp2/3-dependent actin regulation. J Biol Chem. 287, 27217-27226 (2012).
- Amberg, D. C. Three-dimensional imaging of the yeast actin cytoskeleton through the budding cell cycle. Mol Biol Cell. 9, 3259-3262 (1998).
- Pelham, R. J., Chang, F. Role of actin polymerization and actin cables in actin-patch movement in Schizosaccharomyces pombe. Nat Cell Biol. 3, 235-244 (2001).
- Vavylonis, D., Wu, J. Q., Hao, S., O’Shaughnessy, B., Pollard, T. D. Assembly mechanism of the contractile ring for cytokinesis by fission yeast. Science. 319, 97-100 (2008).
- Bertin, A., et al. Three-dimensional ultrastructure of the septin filament network in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 23, 423-432 (2012).
- Senning, E. N., Marcus, A. H. Actin polymerization driven mitochondrial transport in mating S. cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 107, 721-725 (2010).
- Breitsprecher, D., Kiesewetter, A. K., Linkner, J., Faix, J. Analysis of actin assembly by in vitro TIRF microscopy. Methods Mol Biol. 571, 401-415 (2009).
- Popp, D., Narita, A., Iwasa, M., Maeda, Y., Robinson, R. C. Molecular mechanism of bundle formation by the bacterial actin ParM. Biochem Biophys Res Commun. 391, 1598-1603 (2010).
- Trache, A., Lim, S. M. Live cell response to mechanical stimulation studied by integrated optical and atomic force microscopy. J Vis Exp. (44), (2010).
- Spira, F., Dominguez-Escobar, J., Muller, N., Wedlich-Soldner, R. Visualization of cortex organization and dynamics in microorganisms, using total internal reflection fluorescence microscopy. J Vis Exp. (63), e3982 (2012).
- Manneville, J. B. Use of TIRF microscopy to visualize actin and microtubules in migrating cells. Methods Enzymol. 406, 520-532 (2006).
- Cook, R. K., Sheff, D. R., Rubenstein, P. A. Unusual metabolism of the yeast actin amino terminus. J Biol Chem. 266, 16825-16833 (1991).
- Feng, L., et al. Fluorescence probing of yeast actin subdomain 3/4 hydrophobic loop 262-274. Actin-actin and actin-myosin interactions in actin filaments. J Biol Chem. 272, 16829-16837 (1997).
- Lin, M. C., Galletta, B. J., Sept, D., Cooper, J. A. Overlapping and distinct functions for cofilin, coronin and Aip1 in actin dynamics in vivo. J Cell Sci. 123, 1329-1342 (2010).
- Malloy, L. E., et al. Thoracic Aortic Aneurysm (TAAD)-causing Mutation in Actin Affects Formin Regulation of Polymerization. J Biol Chem. 287, 28398-28408 (2012).
- Smyth, J. W., Shaw, R. M. Visualizing ion channel dynamics at the plasma membrane. Heart Rhythm. 5, S7-S11 (2008).
- Bhattacharya, R., et al. Recruitment of vimentin to the cell surface by beta3 integrin and plectin mediates adhesion strength. J Cell Sci. 122, 1390-1400 (2009).
- Hetheridge, C., et al. The formin FMNL3 is a cytoskeletal regulator of angiogenesis. J Cell Sci. 125, 1420-1428 (2012).
- Bergeron, S. E., et al. Allele-specific effects of thoracic aortic aneurysm and dissection alpha-smooth muscle actin mutations on actin function. J Biol Chem. 286, 11356-11369 (2011).
