Aip1p Dynamics ändras genom den R256H Mutation i aktin
Summary
Sjukdomsframkallande mutationer i aktin kan förändra cytoskeletal funktion. Cytoskelettala dynamik kvantifieras genom avbildning av fluorescerande taggade proteiner med hjälp av total inre fluorescensmikroskopi. Som ett exempel har den cytoskelettprotein, Aip1p, förändrad lokalisering och rörelse i celler som uttrycker den mutanta aktin isoformen, R256H.
Abstract
Mutationer i aktin orsaka en rad mänskliga sjukdomar på grund av specifika molekylära förändringar som ofta förändrar cytoskeletal funktion. I denna studie, avbildning av fluorescerande taggade proteiner med hjälp av total inre fluorescens (TIRF) mikroskopi används för att visualisera och kvantifiera förändringar i cytoskelettala dynamik. TIRF mikroskopi och användning av fluorescerande markörer möjliggör också kvantifiering av förändringarna i cytoskelettala dynamik som orsakas av mutationer i aktin. Med denna teknik, kvantifiering av cytoskelettala funktion i levande celler kompletterar värdefullt in vitro studier av proteiners funktion. Som ett exempel har missense-mutationer som påverkar aktin rest R256 identifierats i tre humana aktin isoformer antyder denna aminosyra spelar en viktig roll i reglerande interaktioner. Effekterna av aktin mutationen R256H på cytoskelettala rörelser studerades med hjälp av jästmodellen. Proteinet, Aip1, som är känd för att hjälpa till kofilin i aktin depolymerisation, vartaggade med grönt fluorescerande protein (GFP) vid N-terminus och spåras in vivo med användning TIRF mikroskopi. Hastigheten för Aip1p rörelse i både vildtyp-och mutantstammar kvantifierades. I celler som uttrycker R256H mutant aktin, är Aip1p rörelse begränsas och rörelsehastigheten är nästan hälften av den uppmätta i vildtyp celler (0,88 ± 0,30 ìm / sek i R256H celler jämfört med 1,60 hastigheten ± 0,42 nm / sek i vildtyp celler, p <0,005).
Introduction
Aktin är det dominerande proteinet består av cytoskelettet och deltar i viktiga cellulära processer, inklusive celldelning, organeller rörelse, cellmotilitet, kontraktion, och signalering. Under det senaste årtiondet har sjukdomsframkallande mutationer i aktin upptäckts i var och en av de sex mänskliga aktin isoformer som leder till en rad olika sjukdomar, från myopatier till kranskärlssjukdom 1-7. De processer genom vilka aktin mutationer leder till sjukdomar fortsätter att belysas. Jästen modellen fortfarande den gyllene standarden för att studera de biokemiska effekter av mutationer på aktin funktion på grund av fördelarna med den enda väsentliga aktin isoform, genetisk spårbarhet och hög bevarande av aktin sekvens och funktion. Studier visar att enskilda aktin mutationer leder till molekylära specifika dysfunktioner med dominanta negativa effekter 8. Till exempel dövhet framkallande mutationer i γ-non-muskel aktin som påverkar Lys-118 rest ändra regleringen avaktin bindande protein Arp2 / 3 9. Studier anställer ofta in vitro analyser av protein: protein interaktioner. Undersökningar av effekten av aktin mutationer på cellbiologi och, i synnerhet, aktinbindande protein lokalisering i cellen är begränsade.
Studier av jästen cytoskelettet in vivo förlitar konventionellt på bilder av fasta celler från ett inverterat fluorescensmikroskop 10. Dessa experiment levereras grundläggande data om morfologi aktin cytoskelettet. Undersökningar har sedan införlivats tredimensionell konfokal avbildning för att visualisera komplexa cytoskeletal nätet 11, 12. Denna avbildning möjliggör kvantifiering av överflödet och relativa placering av aktin patchar och filament. Tunna avsnitt elektron tomografi har använts för att bilden morfologi de täta trådformiga nätverk relativt bevarade subcellulära strukturer 13. Trång cellulära stakt med ett litet tvärsnitt kan undersökas i fina detaljer med denna teknik. Imaging studier har utvidgats till att levande celler med intervall fluorescerande mikroskopi. När fotoblekning och bakgrundsfluorescens kan modereras, möjliggör tidsförlopp avbildning undersökningar om dynamiken i cytoskelettproteiner och svar på miljöförhållanden 11, 14. Separat sattes visualisering av dynamiken hos aktinfilament in vitro avancerat genom införandet av total intern reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi. Jämfört med brett fält mikroskopi, har TIRF fördelen av minskade bakgrundsfluorescens och förbättrad kontrast för att övervaka individuella filament 15, 16. Med dessa egenskaper har TIRF mikroskopi anpassats av cellbiologer att övervaka cellulära strukturer på plasmamembranet 17, 18. Cellulära händelser, inklusive förändring i cytoskelettet, kanvisualiseras i realtid med låg fototoxicitet, maximal kontrast och minimal bakgrunds blomningstid 19.
För att bättre förstå effekten av aktin mutationer på rörelsen, lokalisering, och omsättningen av cytoskelettproteiner i cellen, TIRF mikroskopi och proteintaggning användes. Häri finns metoder för att studera effekterna av en kliniskt relevant mutation i aktin på cytoskelettala dynamik i Saccharomyces cerevisiae beskrivs. Specifikt lokalisering och rörelse aktin bindande protein, Aip1p, visualiserades och kvantifieras i celler som uttrycker R256H-mutationen i aktin. Dessa tekniker komplement in vitro biokemiska studier och möjliggöra en större förståelse för proteininteraktioner och funktioner.
Protocol
Representative Results
Discussion
En effektiv strategi för att visualisera dynamiken i cytoskelettet och nyttan i utredningar om patogena mutationer har beskrivits här. Avancerade avbildningsmetoder har skapat nya möjligheter att förstå den intracellulära rörelsen av proteiner nära cellmembranet. Total inre reflektion fluorescensmikroskopi (TIRF) är en känslig teknik för funktionella studier i levande celler. TIRF använder en vinklad excitation laser som skapar ett evanescent fält på grund av skillnaden i brytningsindex för täckglas och …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Peter Rubenstein för nyttig diskussion och teknisk rådgivning och David Pellman för den ursprungliga PB1996 klon. Detta arbete stöddes av ett bidrag från March of Dimes och finansiering från Ride för ungarna.
Materials
| Agarose | rpi | 9012-36-6 | |
| Bromophenol Blue | Amresco | 115-39-9 | |
| BSA | NEB | B9001S | |
| Change-IT Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis Kit | USB Corporation | 4166059 | |
| CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| DNA, single stranded from salmon testes | Sigma | 9007-49-2 | |
| EDTA pH 7.4 | Sigma | 93302 | |
| Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585-011 | Warning! Harmful irritation |
| Fungal/Bacterial DNA Kit | Symo Research | D6005 | |
| HpaI | NEB | R0105S | |
| Lithium Acetate | AlfaAesar | 6108-17-4 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10068-013 | |
| NE Buffer #4 | NEB | B7004S | |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Invitrogen | 12532-016 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | Any kit will work |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Sodium azide | Sigma | 26628-22-8 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-023 | |
| PEG | Amresco | 25322-68-3 | |
| Tris Base Ultrapure | rpi | 77-86-1 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | 1/6/2015 | |
| XhoI | NEB | R0146S | |
| XmaI | NEB | R0180S | |
| YPD media | LabExpress | 3011 | |
| -URA Media | LabExpress | 3010 | |
| PCR Machine | Invitrogen | 4359659 | Any PCR machine will work |
| TIRF Microscope | Olympus IX81 | ||
| Hamamatsu ORCA-R camera | Hamamatsu |
References
- Lehtonen, H. J., et al. Segregation of a missense variant in enteric smooth muscle actin gamma-2 with autosomal dominant familial visceral myopathy. Gastroenterology. 143, 1482-1491 (2012).
- Matsson, H., et al. Alpha-cardiac actin mutations produce atrial septal defects. Hum Mol Genet. 17, 256-265 (2008).
- Zhu, M., et al. Mutations in the gamma-actin gene (ACTG1) are associated with dominant progressive deafness (DFNA20/26). Am J Hum Genet. 73, 1082-1091 (2003).
- Nowak, K. J., et al. Mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene in patients with actin myopathy and nemaline myopathy. Nat Genet. 23, 208-212 (1999).
- Olson, T. M., Michels, V. V., Thibodeau, S. N., Tai, Y. S., Keating, M. T. Actin mutations in dilated cardiomyopathy, a heritable form of heart failure. Science. 280, 750-752 (1998).
- Riviere, J. B., et al. De novo mutations in the actin genes ACTB and ACTG1 cause Baraitser-Winter syndrome. Nat Genet. 44, 440-444 (2012).
- Guo, D. C., et al. Mutations in smooth muscle alpha-actin (ACTA2) lead to thoracic aortic aneurysms and dissections. Nat Genet. 39, 1488-1493 (2007).
- Sparrow, J. C., et al. Muscle disease caused by mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene (ACTA1). Neuromuscul Disord. 13, 519-531 (2003).
- Kruth, K. A., Rubenstein, P. A. Two deafness-causing (DFNA20/26) actin mutations affect Arp2/3-dependent actin regulation. J Biol Chem. 287, 27217-27226 (2012).
- Amberg, D. C. Three-dimensional imaging of the yeast actin cytoskeleton through the budding cell cycle. Mol Biol Cell. 9, 3259-3262 (1998).
- Pelham, R. J., Chang, F. Role of actin polymerization and actin cables in actin-patch movement in Schizosaccharomyces pombe. Nat Cell Biol. 3, 235-244 (2001).
- Vavylonis, D., Wu, J. Q., Hao, S., O’Shaughnessy, B., Pollard, T. D. Assembly mechanism of the contractile ring for cytokinesis by fission yeast. Science. 319, 97-100 (2008).
- Bertin, A., et al. Three-dimensional ultrastructure of the septin filament network in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 23, 423-432 (2012).
- Senning, E. N., Marcus, A. H. Actin polymerization driven mitochondrial transport in mating S. cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 107, 721-725 (2010).
- Breitsprecher, D., Kiesewetter, A. K., Linkner, J., Faix, J. Analysis of actin assembly by in vitro TIRF microscopy. Methods Mol Biol. 571, 401-415 (2009).
- Popp, D., Narita, A., Iwasa, M., Maeda, Y., Robinson, R. C. Molecular mechanism of bundle formation by the bacterial actin ParM. Biochem Biophys Res Commun. 391, 1598-1603 (2010).
- Trache, A., Lim, S. M. Live cell response to mechanical stimulation studied by integrated optical and atomic force microscopy. J Vis Exp. (44), (2010).
- Spira, F., Dominguez-Escobar, J., Muller, N., Wedlich-Soldner, R. Visualization of cortex organization and dynamics in microorganisms, using total internal reflection fluorescence microscopy. J Vis Exp. (63), e3982 (2012).
- Manneville, J. B. Use of TIRF microscopy to visualize actin and microtubules in migrating cells. Methods Enzymol. 406, 520-532 (2006).
- Cook, R. K., Sheff, D. R., Rubenstein, P. A. Unusual metabolism of the yeast actin amino terminus. J Biol Chem. 266, 16825-16833 (1991).
- Feng, L., et al. Fluorescence probing of yeast actin subdomain 3/4 hydrophobic loop 262-274. Actin-actin and actin-myosin interactions in actin filaments. J Biol Chem. 272, 16829-16837 (1997).
- Lin, M. C., Galletta, B. J., Sept, D., Cooper, J. A. Overlapping and distinct functions for cofilin, coronin and Aip1 in actin dynamics in vivo. J Cell Sci. 123, 1329-1342 (2010).
- Malloy, L. E., et al. Thoracic Aortic Aneurysm (TAAD)-causing Mutation in Actin Affects Formin Regulation of Polymerization. J Biol Chem. 287, 28398-28408 (2012).
- Smyth, J. W., Shaw, R. M. Visualizing ion channel dynamics at the plasma membrane. Heart Rhythm. 5, S7-S11 (2008).
- Bhattacharya, R., et al. Recruitment of vimentin to the cell surface by beta3 integrin and plectin mediates adhesion strength. J Cell Sci. 122, 1390-1400 (2009).
- Hetheridge, C., et al. The formin FMNL3 is a cytoskeletal regulator of angiogenesis. J Cell Sci. 125, 1420-1428 (2012).
- Bergeron, S. E., et al. Allele-specific effects of thoracic aortic aneurysm and dissection alpha-smooth muscle actin mutations on actin function. J Biol Chem. 286, 11356-11369 (2011).
