و<em> في المختبر</em> نموذج لدراسة الفيزيولوجيا المرضية الخلوي في الخلية حثل المادة البيضاء الكروي
Summary
Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.
Abstract
وظيفة محددة من الخلايا الدبقية الصغيرة متعددة الأنوية، تسمى خلايا الكروي، التي هي وفيرة فريد في النظام العصبي المركزي من حثل المادة البيضاء الكروي الخلايا (GLD) غير واضحة. وقد أعاقت هذه الفجوة في المعرفة من خلال عدم وجود الاقتضاء في النموذج المختبر للدراسة. هنا، نحن تصف الفئران نظام الثقافة الدبقية الأساسي في العلاج مع النتائج التي سيكوزين في الانوية من الخلايا الدبقية الصغيرة تشبه الخلايا كروي الشكل المميزة وجدت في شعبة الشؤون القانونية العامة. باستخدام هذا النظام المبتكر، حددنا شروط وطرق التحليل للدراسة الخلايا الكروي. تم التحقق من صحة الاستخدام المحتمل لهذا النظام نموذجا في دراستنا السابقة، والتي حددت دور محتمل للمصفوفة الفلزي (MMP) -3 في شعبة الشؤون القانونية العامة. هذه الرواية في نظام المختبر قد تكون نموذجا مفيدا للدراسة تشكيل وظيفة، ولكن أيضا التلاعب العلاجية المحتملة، من هذه الخلايا الفريدة من نوعها.
Introduction
حثل المادة البيضاء الكروي الخلية (GLD)، المعروف أيضا باسم مرض كرابه، هو مرض قاتل المزيل الناتجة عن فقدان وظيفة الطفرات في galatocerebrosidase (galc) الجين 1. الشكل الأكثر شيوعا من GLD هو البديل الطفولي الذي تمثله في بداية مرحلة الطفولة المبكرة وتتميز نمطا سريريا من السيارات والتدهور المعرفي يؤدي إلى الوفاة المبكرة غالبا قبل سن الخامسة 2،3. وتستخدم الاختبارات الجينية للتحقق من تشخيص GLD 4. أمراض الأعصاب من GLD يكشف إزالة الميالين على نطاق واسع، وضمور الخلايا العصبية، دباق النجمي وجود محتقن الخلايا الدبقية الصغيرة متعددة الأنوية تسمى خلايا كروي الشكل 5-7. تحديد خلايا كروي الشكل، وغالبا ما تحتوي على شوائب نبيبي في السيتوبلازم بها، لقد كان السمة المميزة لشعبة الشؤون القانونية العامة على مدى السنوات 97 الماضية، على الرغم من أن ظلت وظيفة معينة من هذه الخلايا واضحة بعيد المنال.
مشاركة غير myel-منذ فترة طويلة تعتبر inating الدبقية (الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية) في التسبب في GLD استجابة الثانوية إلى إزالة الميالين عميق في هذا المرض 8. ومن المثير للاهتمام، وأول وصف لهذا المرض، الذي أدلى به كنود كرابه 5 في عام 1916، وتشكيل ذكرت من البالعات متعددة النوى التي تحتوي على الدهون الحطام التي تم اسمه 'الكروي الخلايا وهي السمة المميزة لهذا المرض.
خلايا الكروي هي سمة مميزة لGLD علم الأمراض، على الرغم منذ فترة طويلة تجاهل دورها في GLD. ومن المثير للاهتمام، وهذه الخلايا هي من بين أولى التغييرات المميزة في أنسجة الجهاز العصبي المركزي GLD. هذا النقص في المعرفة قد يكون بسبب افتراض أن تشكيل البالعات متعددة النوى، تسمى الخلايا العملاقة في أمراض أخرى، تعتبر عادة نتيجة للأمراض المسببة للأمراض بدلا من القوة الدافعة الأولية 9. ولذلك، كانت هناك دراسات قليلة للتحقق من الآلية التي كتبها مبادرة الخوذ البيضاءتتشكل خلايا الكروي CH من البالعات، وخاصة في الجهاز العصبي المركزي من GLD. الإجراء الموضح في هذا التقرير يركز على أهمية تشكيل الكروي الخلايا في الجهاز العصبي المركزي ومظاهرة لدينا السابقة التي يسببها سيكوزين الانوية من الخلايا الدبقية الصغيرة في المختبر، وعرضت هذه الخلايا مستويات أعلى من النشاط البلعمة. واتساقا مع هذه الملاحظات، والخلايا في أدمغة الكروي twitcher كثيرا ما تحتوي-PAS إيجابي الحطام، مما يشير إلى ارتفاع مستويات نشاط البلعمة. تم العثور على خلايا كروي الشكل أيضا أن يكون immunopositive لالفيريتين (علامة الخلايا الدبقية الصغيرة) 10، KP-1 / CD68 (علامة الوحيدات)، وبعضها أيضا إيجابية لvimentin (بروتين خيوط وسيطة وعلامة من الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة تفعيلها) 11، HLA-DRA (وهي مستقبلات سطح MHCII)، و TNF-α 7، وإيبا-1 (بروتين ملزمة الكالسيوم المستخدمة لتحديد الخلايا الدبقية الصغيرة) 12. وبناء على هذه المجموعة من علامات، وخلايا الكروي تنشأ من الخلايا الدبقية الصغيرة التي تنميالنمط الظاهري فريدة من نوعها.
على الرغم من طابعها الفريد، تم التغاضي عن وظيفة محددة ومساهمة GCS إلى GLD المرضية إلى حد كبير. كان يظن خلايا الكروي لتكون نتيجة ثانوية للإزالة الميالين المزمن. ومع ذلك، فقد حددت دراسات سابقة دراسة جمعية الزمنية للخلايا الكروي لعلم الأمراض المسألة الأبيض من GLD وجود خلايا الكروي في أواخر الجنينية لفترة ما بعد الولادة في وقت مبكر؛ الأوقات التي سبقت موت الخلايا المبرمج دبقية قليلة التغصن وإزالة الميالين العلني 13. وهكذا، فإن التسلسل الزمني لتطور أمراض الأعصاب في GLD تشير إلى أن الخلايا الكروي تتشكل في وقت مبكر من إزالة الميالين في هذا المرض 14. وأدى ذلك إلى فرضيتنا أن تشكيل المبكر للخلايا الكروي في GLD قد تمثل حدثا الممرضة تحديد بدلا من الثانوية، والاستجابة التفاعلية للتلف دبقية قليلة التغصن 15. بالإضافة إلى ذلك، فقد اعتبر ديسريغولاتيون النشاط دبقية في GLD والواقعص تحد من فعالية على المدى الطويل hematopeotic العلاج بالخلايا الجذعية لعلاج هذا المرض 16. وهكذا، والتحقيق في الوظائف الخلوية وتنظيم الخلايا الدبقية الصغيرة، وخلايا الكروي، ردا على سيكوزين من المتوقع أن توفر رؤى جديدة في التسبب في GLD.
حتى وقت قريب، كان عدم وجود نموذج مناسب للدراسة تشكيل خلية الكروي محدودة فهم وظيفة محددة ومساهمة هذه الخلايا للأمراض من GLD. في الدراسات الحديثة، تقرر أن الخلايا الكروي مثل يمكن تشكيلها في استجابة مباشرة لسيكوزين، وهو توكسين الدهون التي تتراكم العدوى في GLD. وجدنا أن الخلايا الدبقية الصغيرة، ولكن ليس الضامة، يتم تنشيط وتحويلها إلى خلايا الكروي في الثقافات الدبقية الأولية ردا على سيكوزين 15. تم العثور على هذا التحول إلى خلايا الكروي أن بوساطة البروتيني خارج الخلية، الفلزي مصفوفة (MMP) -3 15. وفي الآونة الأخيرة، فإنناقمنا بمد هذه النتائج وقرر أن الخلايا الدبقية الصغيرة وتنشيط خلايا الكروي سيكوزين المتقدمة في هذا المختبر في نظام نموذجي هي أكثر قدرة سامة للخلايا والخلايا قليلة التغصن دبقية قليلة التغصن السلف. وبالتالي، عندما اعتبر في سياق GLD، وتراكم في وقت مبكر من سيكوزين وتشكيل خلايا الكروي قبل إزالة الميالين ستدعم دورا الابتدائي وربما العدوى الناشئة عن الخلايا الدبقية الصغيرة في هذا المرض.
نقترح دراسة تشكيل خلية الكروي سوف تكشف معلومات جديدة عن التسبب في GLD من شأنها أن تسهم في فهمنا لهذا المرض. وعلاوة على ذلك، هذا النموذج الخلوي الجديد من GLD قد توفر شكلا جديدا من النهج الذي علاجية جديدة لمعالجة يمكن اختبارها تغيرات مرضية في هذا المرض. وبالتالي، في هذا التقرير نقدم بروتوكول مفصلة لتطوير في المختبر من خلايا كروي الشكل الناجم عن سيكوزين من الثقافات الأولية من غير myelinating الدبقية.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول الموصوفة هنا يوفر النظام نموذج جديد للدراسة تطوير وتوصيف وظيفي لتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا الكروي. العمل مسبق من ايم وآخرون. باستخدام خط الخلية HEK293 قدمت نموذجا لتطوير هذا البروتوكول لدراسة تشكيل خلية الكروي 21. ومن المهم أيضا أن نشير ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG 5001-A-3 to S.J.C.), the National Institutes of Health (NS065808 to E.R.B.; NS078392 to S.J.C.), start-up funds from the UConn Health Center (to SJC) and the Kim Family Fund (UCHC in support of K.I.C.).
Materials
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg2+ and Ca2+). | Life technologies | 14175-095 |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi | 130-092-628 |
| 40 uM cell-strainer | Fisherbrand | 22363547 |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg2+ and Ca2+). | Gibco | 14025-092 |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 |
| fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 |
| Penicilin/Streptomycin | Life technologies | 15070-063 |
| Laminin | Sigma | L2020 |
| Trypsin-EDTA solution | Life technologies | 25299-056 |
| Psychosine | Sigma | P9256 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 19208 |
| Normal Goat Serum (NGS) | Invitrogen | PCN5000 |
| Iba-1 | WAKO | 019-19741 |
| Alexa Fluor conjugated antisera | Life Technologies | Various |
| Mounting Media | Southern Biotech | OB100-01 |
| Phagocytic Assay Kit | Cayman Chemicals | 500290 |
| HEPES | Sigma | BP310-500 |
References
- Rafi, M. A., Luzi, P., Chen, Y. Q., Wenger, D. A. A large deletion together with a point mutation in the GALC gene is a common mutant allele in patients with infantile Krabbe disease. Hum Mol Genet. 4, 1285-1289 (1995).
- Duffner, P. K., et al. The long-term outcomes of presymptomatic infants transplanted for Krabbe disease: report of the workshop held on July 11 and 12. Genet Med. 11, 450-454 (2008).
- Duffner, P. K., Jalal, K., Carter, R. L. The Hunter’s Hope Krabbe family database. Pediatr Neurol. 40, 13-18 (2009).
- Duffner, P. K., et al. Newborn screening for Krabbe disease: the New York State model. Pediatr Neurol. 40, 245-252 (2009).
- Krabbe, K. A new familial, infantile form of brain sclerosis. Brain. 39, 74-114 (1916).
- Percy, A. K., Odrezin, G. T., Knowles, P. D., Rouah, E., Armstrong, D. D. Globoid cell leukodystrophy: comparison of neuropathology with magnetic resonance imaging. Acta Neuropathol. 88, 26-32 (1994).
- Itoh, M., et al. Immunohistological study of globoid cell leukodystrophy. Brain Dev. 24, 284-290 (2002).
- Reddy, A. S., Patel, J. R., Vogler, C., Klein, R. S., Sands, M. S. Central nervous system pathology progresses independently of KC and CXCR2 in globoid-cell leukodystrophy. PLoS One. 8, (2013).
- McNally, A. K., Anderson, J. M. Macrophage fusion and multinucleated giant cells of inflammation. Adv Exp Med Biol. 713, 97-111 (2011).
- Kaneko, Y., Kitamoto, T., Tateishi, J., Yamaguchi, K. Ferritin immunohistochemistry as a marker for microglia. Acta Neuropathol. 79, 129-136 (1989).
- Graeber, M. B., Streit, W. J., Kreutzberg, G. W. The microglial cytoskeleton: vimentin is localized within activated cells in situ. J Neurocytol. 17, 573-580 (1988).
- Kondo, Y., Adams, J. M., Vanier, M. T., Duncan, I. D. Macrophages counteract demyelination in a mouse model of globoid cell leukodystrophy. J Neurosci. 31, 3610-3624 (2011).
- Pollanen, M. S., Brody, B. A. Fetal globoid cell leukodystrophy. Arch Pathol Lab Med. 114, 213-216 (1990).
- Martin, J. J., et al. Fetal Krabbe leukodystrophy. A morphologic study of two cases. Acta Neuropathol. 53, 87-91 (1981).
- Ijichi, K., et al. MMP-3 mediates psychosine-induced globoid cell formation: Implications for leukodystrophy pathology. Glia. , (2013).
- Pellegatta, S., et al. The therapeutic potential of neural stem/progenitor cells in murine globoid cell leukodystrophy is conditioned by macrophage/microglia activation. Neurobiol Dis. 21, 314-323 (2006).
- Crocker, S. J., Milner, R., Pham-Mitchell, N., Campbell, I. L. Cell and agonist-specific regulation of genes for matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors by primary glial cells. Journal of Neurochemistry. 98, 812-823 (2006).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. , (2013).
- Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia. Glia. 56, 1187-1198 (2008).
- Moore, C. S., et al. Astrocytic Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 (TIMP-1) Promotes Oligodendrocyte Differentiation and Enhances CNS Myelination. J Neurosci. 31, 6247-6254 (2011).
- Im, D. S., Heise, C. E., Nguyen, T., O’Dowd, B. F., Lynch, K. R. Identification of a molecular target of psychosine and its role in globoid cell formation. J Cell Biol. 153, 429-434 (2001).
