Ein<em> In-vitro-</em> Modell für die Untersuchung der zellulären Pathophysiologie in Globoidzell- Leukodystrophie
Summary
Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.
Abstract
Die genaue Funktion der Mehrkern Mikroglia genannt Globoidzellen, die im Zentralnervensystem Globoidzell Leukodystrophie (GLD) eindeutig reichlich sind, ist unklar. Diese Wissenslücke wurde durch den Mangel eines geeigneten in vitro-Modell zur Untersuchung behindert. Hier beschreiben wir einen primären murinen Gliazellen Kultursystem, in dem die Behandlung mit Psychosin ergibt multinucleation der Mikroglia ähnlich den Kenn Globoidzellen in GLD gefunden. Mit diesem neuartigen System definierten wir die Bedingungen und Formen der Analyse für das Studium der Globoidzellen. Die mögliche Verwendung von diesem Modellsystem wurde in unserer vorherigen Studie, die eine mögliche Rolle für die Matrix-Metalloproteinase (MMP) identifiziert validiert -3 in GLD. Diese neuartige in vitro-System kann ein nützliches Modell, in dem die Bildung und Funktion, sondern auch die potentielle therapeutische Manipulation dieser einzigartigen Zellen zu studieren.
Introduction
Globoidzell Leukodystrophie (GLD), auch als Morbus Krabbe genannt, ist eine tödliche demyelinisierende Krankheit von Funktionsverlust-Mutationen in der galatocerebrosidase (GALC) Gen 1 resultieren. Die am weitesten verbreitete Form der GLD ist die Kinder-Variante, die von Beginn in der frühen Kindheit und typisiert wird, gekennzeichnet durch einen aggressiven klinischen Verlauf der motorischen und kognitiven Rückgang führt zu vorzeitigem Tod oft vor Ablauf von fünf Jahren 2,3. Genetische Tests wird verwendet, um eine Diagnose der GLD 4 überprüfen. Neuropathologie der GLD enthüllt weit verbreitete Demyelinisierung, neuronale Atrophie, Astrogliose und Gegenwart angeschwollen mehrkern Mikroglia genannt Globoidzellen 5-7. Die Identifizierung von Globoidzellen, oft tubulous Einschlüsse in ihrem Zytoplasma enthält, hat in den letzten 97 Jahre zu einem prägenden Merkmal der GLD, obwohl die spezifische Funktion dieser Zellen ist auffällig vor schwer.
Die Beteiligung von Nicht-MYELUrsprung Gliazellen (Astrozyten und Mikroglia) in der Pathogenese der GLD ist seit langem als eine sekundäre Reaktion auf die tiefgreifenden Demyelinisierung bei dieser Erkrankung 8. Interessant ist, dass die erste Beschreibung dieser Krankheit, von Knud Krabbe 1916 5 gemacht, berichtete die Bildung von mehrkernigen Phagozyten, lipidhaltigen Ablagerungen, die genannt worden 'Globoidzellen' und sind ein charakteristisches Merkmal dieser Krankheit.
Globoidzellen sind das Markenzeichen Merkmal der GLD Pathologie, obwohl ihre Rolle in der GLD ist seit langem ignoriert. Interessanterweise sind diese Zellen zu den ersten charakteristischen Veränderungen in ZNS-Gewebe von GLD. Dieser Mangel an Wissen kann auf der Annahme, daß die Bildung von vielkernigen Phagozyten genannte Riesenzellen bei anderen Krankheiten, werden typischerweise als eine Folge der Pathologie als eher als eine anfängliche Antriebskraft pathogenen 9 gewesen. Daher gibt es nur wenige Studien zur Untersuchung des Mechanismus, durch WHICH Globoidzellen von Phagozyten insbesondere im ZNS von GLD gebildet. Die in diesem Bericht beschriebenen Verfahren konzentriert sich auf die Bedeutung der Globoidzell Bildung im ZNS und unseren bisherigen Nachweis, dass Psychosin-induzierte multinucleation der Mikroglia in vitro und diese Zellen zeigten höhere Phagozytose. In Übereinstimmung mit diesen Beobachtungen, Globoidzellen in twitcher Gehirne enthalten häufig PAS-positive Ablagerungen, was hohe Phagozytose. Globoidzellen finden sich auch immun für Ferritin zu sein (a Mikroglia-Marker) 10, KP-1 / CD68 (a Monozyten-Marker), und einige sind auch positiv für Vimentin (ein Zwischen Filament-Protein und Marker für Astrozyten und aktivierte Mikroglia) 11, HLA-DRa (ein MHCII Oberflächenrezeptor) und TNF-α 7 und Iba-1 (ein Calcium-Bindungsprotein verwendet, um zu identifizieren Mikroglia) 12. Auf der Grundlage dieser Sammlung von Markern, Globoidzellen stammen aus Mikrogliazellen, die sich entwickelnein einzigartiges Phänotyp.
Trotz ihrer Einzigartigkeit wurde die spezifische Funktion und der Beitrag der GCs zu GLD Pathogenese weitgehend übersehen. Globoidzellen haben gedacht worden, um eine sekundäre Folge der chronischen Demyelinisierung sein. Allerdings ist durch frühere Studien, die die zeitliche Assoziation von Globoidzellen auf der weißen Substanz Pathologie der GLD die Anwesenheit von Globoid Zellen in der späten embryonalen frühen postnatalen Zeit identifiziert; mal vorstehenden Oligodendrozytenapoptose und offene Demyelinisierung 13. Somit wird die zeitliche Abfolge der Entwicklung der Neuropathologie in GLD legt nahe, dass Globoidzellen im Voraus der Demyelinisierung bei dieser Erkrankung 14 ausgebildet. Dies führte zu unserer Hypothese, dass die frühe Bildung von Globoidzellen in GLD kann eine Definition von pathogenen Veranstaltung eher als eine sekundäre, reaktive Antwort auf Oligodendrozyten-Schaden 15 stellen. Zusätzlich Dysregulation der Mikroglia-Aktivität in GLD ist als ein factor Begrenzung der Langzeitwirksamkeit von hematopeotic Stammzelltherapien für die Behandlung dieser Krankheit 16. Somit untersucht die Zellfunktionen und Regeln der Mikroglia und Globoidzellen in Reaktion auf Psychosin soll neue Einblicke in die Pathogenese von GLD ist.
Bis vor kurzem war das Fehlen eines geeigneten Modells, in dem Globoidzell Bildung zu untersuchen, das Verständnis der genauen Funktion und der Beitrag dieser Zellen zu der Pathologie der GLD beschränkt. In neueren Studien wurde festgestellt, dass Globoid-ähnlichen Zellen können als direkte Reaktion gebildet, um Psychosin, eine pathogene Lipid Toxin, das in GLD sammelt werden. Wir fanden, dass Mikroglia, aber nicht Makrophagen, aktiviert und in Reaktion in Globoidzellen in der Grund Gliakulturen transformiert, um Psychosin 15. Die Umwandlung in Globoidzellen wurde gefunden, durch die extrazelluläre Protease, die Matrix-Metalloproteinase (MMP) -3 15 vermittelt werden. In jüngerer Zeit haben wirhaben diese Ergebnisse, dass Psychosin-aktivierte Mikroglia und Globoidzellen in dieser In-vitro-Modellsystem entwickelt, erweitert und bestimmt sind potent giftig für Oligodendrozyten und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen. Daher wird, wenn im Rahmen der GLD, der frühen Anhäufung von Psychosin und Bildung Globoidzellen vor Demyelinisierung würde eine aufstrebende primären und möglicherweise pathogene Rolle für Mikroglia bei dieser Krankheit unterstützt betrachtet.
Wir schlagen vor, dass die Studie von Globoidzell Bildung wird neue Informationen über die Pathogenese der GLD, die zum Verständnis dieser Krankheit beitragen wird offenbaren. Darüber hinaus kann dieses neue Modell der zellulären GLD ein neues Format, aus denen neue therapeutische Ansätze zur Adresse pathologischen Veränderungen bei dieser Erkrankung getestet werden könnten. Daher wird in diesem Bericht stellen wir ein detailliertes Protokoll für die in vitro Entwicklung von Psychosin induzierte Globoidzellen aus Primärkulturen von nicht-myelinisierenden Glia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hierin beschriebene Protokoll sieht ein neues Modellsystem, in dem die Entwicklung und funktionelle Charakterisierung von aktivierter Mikroglia und Globoidzellen studieren. Frühere Arbeiten von Im et al. mit einer HEK293-Zelllinie ein Template für die Entwicklung des vorliegenden Protokolls für das Studium der Globoidzell Bildung 21. Es ist auch wichtig, darauf hinzuweisen, dass die Globoidzellen im Modell abgeleitet von den nativen Globoidzellen identifizierbar GLD abweichen. Zum Beispiel hab…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG 5001-A-3 to S.J.C.), the National Institutes of Health (NS065808 to E.R.B.; NS078392 to S.J.C.), start-up funds from the UConn Health Center (to SJC) and the Kim Family Fund (UCHC in support of K.I.C.).
Materials
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg2+ and Ca2+). | Life technologies | 14175-095 |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi | 130-092-628 |
| 40 uM cell-strainer | Fisherbrand | 22363547 |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg2+ and Ca2+). | Gibco | 14025-092 |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 |
| fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 |
| Penicilin/Streptomycin | Life technologies | 15070-063 |
| Laminin | Sigma | L2020 |
| Trypsin-EDTA solution | Life technologies | 25299-056 |
| Psychosine | Sigma | P9256 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 19208 |
| Normal Goat Serum (NGS) | Invitrogen | PCN5000 |
| Iba-1 | WAKO | 019-19741 |
| Alexa Fluor conjugated antisera | Life Technologies | Various |
| Mounting Media | Southern Biotech | OB100-01 |
| Phagocytic Assay Kit | Cayman Chemicals | 500290 |
| HEPES | Sigma | BP310-500 |
References
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