Een<em> In Vitro</em> Model voor de studie van cellulaire Pathofysiologie in globoid Cell Leukodystrophy
Summary
Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.
Abstract
De exacte functie van meerdere kernen microglia, genaamd globoid cellen, die uniek overvloedig in het centrale zenuwstelsel van globoid cel leukodystrofie (GLD) is onduidelijk. Deze kloof in kennis is gehinderd door het ontbreken van een geschikt in vitro model voor onderzoek. Hierin beschrijven we een primaire murine gliale kweeksysteem waarin behandeling met psychosine leidt multinucleation van microglia lijkt het kenmerk globoid cellen in GLD. Met behulp van deze nieuwe systeem, hebben we overeenstemming over de voorwaarden en de wijze van analyse voor de studie van globoid cellen. Het potentiële gebruik van dit modelsysteem werd gevalideerd in onze eerdere studie, die een mogelijke rol voor matrix metalloproteïnase (MMP) -3 geïdentificeerd in GLD. Deze nieuwe in vitro systeem kan een nuttig model waarin de vorming en functie, maar ook de potentiële therapeutische manipulatie van deze unieke cellen te bestuderen.
Introduction
Globoid cel leukodystrofie (GLD), ook bekend als de ziekte van Krabbe, een dodelijke demyeliniserende aandoening als gevolg van verlies van functie mutaties in het galatocerebrosidase (GalC) gen 1. De meest voorkomende vorm van GLD is de infantiele variant die wordt gekenmerkt door het begin in de vroege kinderjaren en gekenmerkt door een agressief klinisch beloop van motorische en cognitieve achteruitgang leidt tot een voortijdige dood vaak voor vijf jaar 2,3. Genetische tests worden gebruikt om de diagnose GLD 4 verifiëren. Neuropathologie van GLD onthult wijdverspreide demyelinisatie, neuronale atrofie, astrogliose en aanwezigheid van volgezogen met meerdere kernen microglia genaamd globoid cellen 5-7. De identificatie van globoid cellen, vaak met tubulous insluitsels in hun cytoplasma, is een typisch kenmerk van GLD geweest voor de afgelopen 97 jaar, hoewel de specifieke functie van deze opvallende cellen ongrijpbaar is gebleven.
De betrokkenheid van niet-MYELsprong uit glia (microglia en astrocyten) in de pathogenese van GLD is lang beschouwd als een secundaire respons op de diepe demyelinisatie in deze ziekte 8. Interessant is de eerste beschrijving van deze ziekte, door Knud Krabbe in 1916 5, rapporteerde vorming van meerkernige fagocyten lipide bevattende resten die zijn genoemd 'globoid cellen en zijn een kenmerk van deze ziekte.
Globoid cellen zijn het belangrijkste kenmerk is van GLD pathologie, hoewel hun rol in de GLD is lange tijd genegeerd. Interessant is dat deze cellen tot de vroegste kenmerkende veranderingen in CNS weefsel van GLD. Dit gebrek aan kennis kan veroorzaakt zijn door de aanname dat de vorming van meerkernige fagocyten, genaamd reuzencellen in andere ziekten, worden kenmerkend beschouwd als gevolg van pathologie dan een eerste pathogene motor 9. Daarom zijn er weinig studies die het mechanisme whi geweestch globoid cellen worden gevormd uit fagocyten, met name in het CZS van GLD. De in dit rapport beschreven procedure richt zich op het belang van globoid vorming cel in het CZS en onze vorige demonstratie die-psychosine geïnduceerde multinucleation van microglia in vitro en deze cellen vertoonden hogere niveaus van fagocytose. Consistent met deze waarnemingen, globoid cellen in vogelaar hersenen bevatten vaak PAS-positieve puin, wat suggereert een hoge mate van fagocytose. Globoid cellen zijn ook gevonden immunopositieve voor ferritine te zijn (een microglia marker) 10, KP-1 / CD68 (een monocyt marker), en sommige zijn ook positief voor vimentine (een intermediair filament eiwit en marker van astrocyten en geactiveerde microglia) 11, HLA-DRA (een MHCII oppervlak receptor) en TNF-α 7 en Iba-1 (a calcium bindend eiwit gebruikt voor het identificeren microglia) 12. Op basis van deze verzameling van markers, globoid cellen afkomstig van microglia die zich ontwikkeleneen unieke fenotype.
Ondanks hun uniciteit, heeft de specifieke functie en de bijdrage van de GC te GLD pathogenese grotendeels over het hoofd gezien. Globoid cellen zijn gericht op een secundair gevolg van chronische demyelinisatie. Echter, eerdere studies onderzoeken van de tijdelijke vereniging van globoid cellen aan de witte stof pathologie van GLD de aanwezigheid van globoid cellen in de late embryonale om vroege postnatale periodes geïdentificeerd; tijden voorgaande oligodendrocyte apoptose en openlijke demyelinisatie 13. Aldus, de temporele opeenvolging van ontwikkeling van de neuropathologie in GLD stelt globoid cellen worden gevormd vóór demyelinisatie in deze ziekte 14. Dit leidde tot onze hypothese dat de vroege vorming van globoid cellen in GLD een bepalend pathogene evenement plaats kan vertegenwoordigen dan een secundaire, reactieve reactie op oligodendrocyte schade 15. Daarnaast heeft ontregeling van microgliale activiteit GLD beschouwd een factor het beperken van de lange-termijn effectiviteit van hematopeotic stamcel therapieën voor de behandeling van deze ziekte 16. Aldus onderzoeken van de cellulaire functies en regulering van microglia en globoid cellen in respons op psychosine verwachting nieuwe inzichten in de pathogenese van GLD verschaffen.
Tot voor kort was het ontbreken van een geschikt model om globoid celvorming bestuderen begrip van de precieze functie en de bijdrage van deze cellen aan de pathologie van GLD beperkt. In recente studies werd vastgesteld dat globoid-achtige cellen worden gevormd in directe reactie op psychosine, een pathogeen toxine lipide dat zich ophoopt in GLD. We vonden dat microglia, maar niet macrofagen, worden geactiveerd en omgezet in globoid cellen in primaire gliale culturen in reactie op psychosine 15. Deze transformatie in globoid cellen bleek te zijn gemedieerd door de extracellulaire protease, matrix metalloproteïnase (MMP) -3 15. Meer recent, wehebben deze bevindingen uitgebreid en vastgesteld dat psychosine-geactiveerde microglia en globoid cellen die in dit in vitro model systeem krachtig giftig voor oligodendrocyten en oligodendrocyt progenitorcellen. Vandaar dat, wanneer beschouwd in de context van GLD, het begin van de accumulatie van psychosine en de vorming van globoid cellen voorafgaand aan demyelinisatie zou een opkomende primaire en mogelijk pathogene rol voor microglia bij deze ziekte te steunen.
Wij stellen voor dat de studie van globoid vorming cel zal nieuwe informatie over de pathogenese van GLD, dat zal bijdragen aan ons begrip van deze ziekte te onthullen. Bovendien kan deze nieuwe cellulaire model van GLD een nieuw formaat van waaruit nieuwe therapeutische benaderingen te pakken pathologische veranderingen in deze ziekte zou kunnen worden getest bieden. Vandaar dat in dit rapport geven we een gedetailleerd protocol voor de in vitro ontwikkeling van psychosine geïnduceerde globoid cellen uit primaire kweken van niet myeliniserende glia.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hierin beschreven protocol verschaft een nieuw modelsysteem waarin de ontwikkeling en functionele karakterisatie van geactiveerde microglia en globoid cellen te bestuderen. Eerder werk door Im et al. Gebruik een HEK293 cellijn voorzien in een matrijs voor de ontwikkeling van de onderhavige protocol voor de studie van globoid celvorming 21. Het is ook belangrijk erop te wijzen dat de globoid cellen, afkomstig van het model afwijken van de inheemse globoid cellen herkenbaar in GLD. Zo hebben we rout…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG 5001-A-3 to S.J.C.), the National Institutes of Health (NS065808 to E.R.B.; NS078392 to S.J.C.), start-up funds from the UConn Health Center (to SJC) and the Kim Family Fund (UCHC in support of K.I.C.).
Materials
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg2+ and Ca2+). | Life technologies | 14175-095 |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi | 130-092-628 |
| 40 uM cell-strainer | Fisherbrand | 22363547 |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg2+ and Ca2+). | Gibco | 14025-092 |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 |
| fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 |
| Penicilin/Streptomycin | Life technologies | 15070-063 |
| Laminin | Sigma | L2020 |
| Trypsin-EDTA solution | Life technologies | 25299-056 |
| Psychosine | Sigma | P9256 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 19208 |
| Normal Goat Serum (NGS) | Invitrogen | PCN5000 |
| Iba-1 | WAKO | 019-19741 |
| Alexa Fluor conjugated antisera | Life Technologies | Various |
| Mounting Media | Southern Biotech | OB100-01 |
| Phagocytic Assay Kit | Cayman Chemicals | 500290 |
| HEPES | Sigma | BP310-500 |
References
- Rafi, M. A., Luzi, P., Chen, Y. Q., Wenger, D. A. A large deletion together with a point mutation in the GALC gene is a common mutant allele in patients with infantile Krabbe disease. Hum Mol Genet. 4, 1285-1289 (1995).
- Duffner, P. K., et al. The long-term outcomes of presymptomatic infants transplanted for Krabbe disease: report of the workshop held on July 11 and 12. Genet Med. 11, 450-454 (2008).
- Duffner, P. K., Jalal, K., Carter, R. L. The Hunter’s Hope Krabbe family database. Pediatr Neurol. 40, 13-18 (2009).
- Duffner, P. K., et al. Newborn screening for Krabbe disease: the New York State model. Pediatr Neurol. 40, 245-252 (2009).
- Krabbe, K. A new familial, infantile form of brain sclerosis. Brain. 39, 74-114 (1916).
- Percy, A. K., Odrezin, G. T., Knowles, P. D., Rouah, E., Armstrong, D. D. Globoid cell leukodystrophy: comparison of neuropathology with magnetic resonance imaging. Acta Neuropathol. 88, 26-32 (1994).
- Itoh, M., et al. Immunohistological study of globoid cell leukodystrophy. Brain Dev. 24, 284-290 (2002).
- Reddy, A. S., Patel, J. R., Vogler, C., Klein, R. S., Sands, M. S. Central nervous system pathology progresses independently of KC and CXCR2 in globoid-cell leukodystrophy. PLoS One. 8, (2013).
- McNally, A. K., Anderson, J. M. Macrophage fusion and multinucleated giant cells of inflammation. Adv Exp Med Biol. 713, 97-111 (2011).
- Kaneko, Y., Kitamoto, T., Tateishi, J., Yamaguchi, K. Ferritin immunohistochemistry as a marker for microglia. Acta Neuropathol. 79, 129-136 (1989).
- Graeber, M. B., Streit, W. J., Kreutzberg, G. W. The microglial cytoskeleton: vimentin is localized within activated cells in situ. J Neurocytol. 17, 573-580 (1988).
- Kondo, Y., Adams, J. M., Vanier, M. T., Duncan, I. D. Macrophages counteract demyelination in a mouse model of globoid cell leukodystrophy. J Neurosci. 31, 3610-3624 (2011).
- Pollanen, M. S., Brody, B. A. Fetal globoid cell leukodystrophy. Arch Pathol Lab Med. 114, 213-216 (1990).
- Martin, J. J., et al. Fetal Krabbe leukodystrophy. A morphologic study of two cases. Acta Neuropathol. 53, 87-91 (1981).
- Ijichi, K., et al. MMP-3 mediates psychosine-induced globoid cell formation: Implications for leukodystrophy pathology. Glia. , (2013).
- Pellegatta, S., et al. The therapeutic potential of neural stem/progenitor cells in murine globoid cell leukodystrophy is conditioned by macrophage/microglia activation. Neurobiol Dis. 21, 314-323 (2006).
- Crocker, S. J., Milner, R., Pham-Mitchell, N., Campbell, I. L. Cell and agonist-specific regulation of genes for matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors by primary glial cells. Journal of Neurochemistry. 98, 812-823 (2006).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. , (2013).
- Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia. Glia. 56, 1187-1198 (2008).
- Moore, C. S., et al. Astrocytic Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 (TIMP-1) Promotes Oligodendrocyte Differentiation and Enhances CNS Myelination. J Neurosci. 31, 6247-6254 (2011).
- Im, D. S., Heise, C. E., Nguyen, T., O’Dowd, B. F., Lynch, K. R. Identification of a molecular target of psychosine and its role in globoid cell formation. J Cell Biol. 153, 429-434 (2001).
