Un<em> In Vitro</em> Modello per lo Studio della Fisiopatologia Cellulare in Globoid Leucodistrofia cellulare
Summary
Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.
Abstract
La precisa funzione di microglia multi-nucleata, chiamate cellule globoidi, che sono unicamente abbondanti nel sistema nervoso centrale di leucodistrofia cellulare globoidi (GLD) è chiaro. Questo divario nella conoscenza è stato ostacolato dalla mancanza di un adeguato modello in vitro per lo studio. Qui, descriviamo un sistema di coltura gliale murino primario in cui il trattamento con risultati psicosina in multinucleazione della microglia che ricordano le caratteristiche cellule globoidi trovate in GLD. Con questo nuovo sistema, abbiamo definito le condizioni e le modalità di analisi per lo studio delle cellule globoidi. L'uso potenziale di questo sistema modello è stato validato nel nostro studio precedente, che ha individuato un potenziale ruolo di metalloproteinasi della matrice (MMP) -3 in GLD. Questo nuovo sistema in vitro può essere un modello utile per studiare la formazione e funzione, ma anche il potenziale manipolazione terapeutica di queste cellule uniche.
Introduction
Leucodistrofia cellule Globoid (GLD), nota anche come malattia di Krabbe, è una malattia demielinizzante mortale derivante dalla perdita di funzione mutazioni nel galatocerebrosidase (GALC) gene 1. La forma più diffusa di GLD è la variante infantile, che è caratterizzata da esordio nella prima infanzia e caratterizzata da un decorso clinico aggressivo del motore e del declino cognitivo che porta alla morte prematura, spesso prima di cinque anni di 2,3 anni. Il test genetico viene utilizzato per verificare una diagnosi di GLD 4. Neuropatologia di GLD rivela demielinizzazione diffusa, atrofia neuronale, astrogliosis e la presenza di microglia gonfie multi-nucleate chiamato cellule globoidi 5-7. L'identificazione delle cellule globoidi, spesso contenenti inclusioni tubulosi nel loro citoplasma, è stata una caratteristica distintiva della GLD negli ultimi 97 anni, anche se la specifica funzione di queste cellule cospicui è rimasta inafferrabile.
Il coinvolgimento di non-myelnari glia (astrociti e microglia) nella patogenesi della GLD è stata a lungo considerata una risposta secondaria alla profonda demielinizzazione in questa malattia 8. È interessante notare che la prima descrizione di questa malattia, realizzato da Knud Krabbe nel 1916 5, la formazione riferito fagociti multinucleate contenenti lipidi detriti che sono stati chiamati 'Globoid cellule' e sono una caratteristica di questa malattia.
Cellule globoidi sono la caratteristica segno distintivo di GLD patologia, anche se il loro ruolo nella GLD è stata a lungo ignorata. È interessante notare che queste cellule sono tra i primi cambiamenti caratteristici CNS tessuto GLD. Questa mancanza di conoscenza può essere dovuto al presupposto che la formazione dei fagociti multinucleate, dette cellule giganti in altre malattie, sono tipicamente considerati come conseguenza della patologia piuttosto che una forza trainante patogeno iniziale 9. Pertanto, ci sono stati pochi studi che hanno valutato il meccanismo attraverso il whicellule globoidi ch sono formate da fagociti, soprattutto nel SNC di GLD. La procedura descritta in questo rapporto si concentra sull'importanza della formazione delle cellule globoidi nel sistema nervoso centrale e la nostra precedente dimostrazione che psicosina indotta multinucleazione della microglia in vitro e queste cellule esposte livelli più elevati di attività fagocitaria. Coerentemente con queste osservazioni, globoidi cellule nel cervello twitcher spesso contengono residui PAS-positivo, suggerendo elevati livelli di attività fagocitaria. Globoidi cellule si trovano anche ad essere immunopositive di ferritina (un marcatore microglia) 10, KP-1 / CD68 (un marcatore monociti), e alcuni sono anche positivi per vimentina (una proteina intermedia filamento e marker di astrociti e microglia attivata) 11, HLA-dra (un recettore di superficie MHCII), e TNF-α 7, e Iba-1 (una proteina legante calcio-antagonista usato per identificare microglia) 12. Sulla base di questa collezione di marcatori, cellule globoidi provengono da microglia che si sviluppanoun fenotipo unico.
Nonostante la loro unicità, la funzione e il contributo di GC a GLD patogenesi specifico è stato ampiamente trascurato. Cellule globoidi sono stati pensati per essere una conseguenza secondaria di demielinizzazione cronica. Tuttavia, studi precedenti che esaminano l'associazione temporale delle cellule globoidi alla materia patologia bianco di GLD hanno identificato la presenza di cellule globoidi nel tardo embrionale ai primi periodi post-natale; tempi precedenti l'apoptosi degli oligodendrociti e demielinizzazione conclamata 13. Così, la sequenza temporale di sviluppo della neuropatologia in GLD suggerisce che le cellule globoidi sono formate in anticipo di demielinizzazione in questa malattia 14. Ciò ha portato alla nostra ipotesi che la precoce formazione di cellule globoidi in GLD può rappresentare un evento patogeno che definisce piuttosto che una risposta reattiva secondaria a danno degli oligodendrociti 15. Inoltre, disregolazione delle attività di microglia in GLD è stato considerato un fattor limitando l'efficacia a lungo termine di terapie con cellule staminali hematopeotic per il trattamento di questa malattia 16. Così, indagando le funzioni cellulari e regolazione della microglia e cellule globoidi, in risposta a psicosina dovrebbe fornire nuove intuizioni nella patogenesi della GLD.
Fino a poco tempo, la mancanza di un modello appropriato in cui studiare la formazione delle cellule globoidi aveva limitato la comprensione della funzione e il contributo di queste cellule alla patologia di GLD preciso. In studi recenti, è stato stabilito che le cellule globoidi-come possono essere formati in risposta diretta a psicosina, una tossina lipidi patogeno che si accumula in GLD. Abbiamo scoperto che la microglia, ma non macrofagi, vengono attivati e trasformati in cellule gliali globoidi in colture primarie in risposta a psicosina 15. Questa trasformazione in cellule globoidi è risultato essere mediata dalla proteasi extracellulare, metalloproteinasi della matrice (MMP) -3 15. Più di recente, abbiamohanno esteso questi risultati e determinato che la microglia e cellule globoidi psicosina attivati sviluppate in questo sistema modello in vitro sono potentemente tossico per gli oligodendrociti e le cellule progenitrici degli oligodendrociti. Quindi, se considerato nel contesto della GLD, la precoce accumulo di psicosina e la formazione di cellule globoidi prima di demielinizzazione sosterrebbe un ruolo primario ed eventualmente patogeni emergenti per microglia in questa malattia.
Noi proponiamo che lo studio della formazione delle cellule globoidi rivelerà nuove informazioni sulla patogenesi della GLD che contribuiranno alla nostra comprensione di questa malattia. Inoltre, questo nuovo modello cellulare di GLD può fornire un nuovo formato da cui nuovi approcci terapeutici per affrontare i cambiamenti patologici in questa malattia potrebbero essere testati. Quindi, in questa relazione forniamo un protocollo dettagliato per lo sviluppo in vitro di cellule globoidi psicosina indotta da colture primarie di cellule gliali non-mielinizzanti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui descritto fornisce un nuovo modello di sistema in cui studiare lo sviluppo e la caratterizzazione funzionale di microglia attivate e cellule globoidi. Lavoro preliminare da Im et al. utilizzando una linea cellulare HEK293 ha fornito un modello per lo sviluppo del presente protocollo per lo studio della formazione delle cellule globoidi 21. E 'inoltre importante sottolineare che le cellule derivate globoidi nel modello differiscono dalle cellule globoidi native identificabili in …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG 5001-A-3 to S.J.C.), the National Institutes of Health (NS065808 to E.R.B.; NS078392 to S.J.C.), start-up funds from the UConn Health Center (to SJC) and the Kim Family Fund (UCHC in support of K.I.C.).
Materials
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg2+ and Ca2+). | Life technologies | 14175-095 |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi | 130-092-628 |
| 40 uM cell-strainer | Fisherbrand | 22363547 |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg2+ and Ca2+). | Gibco | 14025-092 |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 |
| fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 |
| Penicilin/Streptomycin | Life technologies | 15070-063 |
| Laminin | Sigma | L2020 |
| Trypsin-EDTA solution | Life technologies | 25299-056 |
| Psychosine | Sigma | P9256 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 19208 |
| Normal Goat Serum (NGS) | Invitrogen | PCN5000 |
| Iba-1 | WAKO | 019-19741 |
| Alexa Fluor conjugated antisera | Life Technologies | Various |
| Mounting Media | Southern Biotech | OB100-01 |
| Phagocytic Assay Kit | Cayman Chemicals | 500290 |
| HEPES | Sigma | BP310-500 |
References
- Rafi, M. A., Luzi, P., Chen, Y. Q., Wenger, D. A. A large deletion together with a point mutation in the GALC gene is a common mutant allele in patients with infantile Krabbe disease. Hum Mol Genet. 4, 1285-1289 (1995).
- Duffner, P. K., et al. The long-term outcomes of presymptomatic infants transplanted for Krabbe disease: report of the workshop held on July 11 and 12. Genet Med. 11, 450-454 (2008).
- Duffner, P. K., Jalal, K., Carter, R. L. The Hunter’s Hope Krabbe family database. Pediatr Neurol. 40, 13-18 (2009).
- Duffner, P. K., et al. Newborn screening for Krabbe disease: the New York State model. Pediatr Neurol. 40, 245-252 (2009).
- Krabbe, K. A new familial, infantile form of brain sclerosis. Brain. 39, 74-114 (1916).
- Percy, A. K., Odrezin, G. T., Knowles, P. D., Rouah, E., Armstrong, D. D. Globoid cell leukodystrophy: comparison of neuropathology with magnetic resonance imaging. Acta Neuropathol. 88, 26-32 (1994).
- Itoh, M., et al. Immunohistological study of globoid cell leukodystrophy. Brain Dev. 24, 284-290 (2002).
- Reddy, A. S., Patel, J. R., Vogler, C., Klein, R. S., Sands, M. S. Central nervous system pathology progresses independently of KC and CXCR2 in globoid-cell leukodystrophy. PLoS One. 8, (2013).
- McNally, A. K., Anderson, J. M. Macrophage fusion and multinucleated giant cells of inflammation. Adv Exp Med Biol. 713, 97-111 (2011).
- Kaneko, Y., Kitamoto, T., Tateishi, J., Yamaguchi, K. Ferritin immunohistochemistry as a marker for microglia. Acta Neuropathol. 79, 129-136 (1989).
- Graeber, M. B., Streit, W. J., Kreutzberg, G. W. The microglial cytoskeleton: vimentin is localized within activated cells in situ. J Neurocytol. 17, 573-580 (1988).
- Kondo, Y., Adams, J. M., Vanier, M. T., Duncan, I. D. Macrophages counteract demyelination in a mouse model of globoid cell leukodystrophy. J Neurosci. 31, 3610-3624 (2011).
- Pollanen, M. S., Brody, B. A. Fetal globoid cell leukodystrophy. Arch Pathol Lab Med. 114, 213-216 (1990).
- Martin, J. J., et al. Fetal Krabbe leukodystrophy. A morphologic study of two cases. Acta Neuropathol. 53, 87-91 (1981).
- Ijichi, K., et al. MMP-3 mediates psychosine-induced globoid cell formation: Implications for leukodystrophy pathology. Glia. , (2013).
- Pellegatta, S., et al. The therapeutic potential of neural stem/progenitor cells in murine globoid cell leukodystrophy is conditioned by macrophage/microglia activation. Neurobiol Dis. 21, 314-323 (2006).
- Crocker, S. J., Milner, R., Pham-Mitchell, N., Campbell, I. L. Cell and agonist-specific regulation of genes for matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors by primary glial cells. Journal of Neurochemistry. 98, 812-823 (2006).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. , (2013).
- Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia. Glia. 56, 1187-1198 (2008).
- Moore, C. S., et al. Astrocytic Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 (TIMP-1) Promotes Oligodendrocyte Differentiation and Enhances CNS Myelination. J Neurosci. 31, 6247-6254 (2011).
- Im, D. S., Heise, C. E., Nguyen, T., O’Dowd, B. F., Lynch, K. R. Identification of a molecular target of psychosine and its role in globoid cell formation. J Cell Biol. 153, 429-434 (2001).
