<em> In Vitro</em> Модель для изучения клеточной патофизиологии в глобоидных Cell Leukodystrophy
Summary
Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.
Abstract
Точная функция мульти-зародышевого микроглии, называется глобоидных клетки, которые являются уникальными в изобилии в центральной нервной системе глобоидных лейкодистрофия клеток (ООВ), неясно. Этот пробел в знаниях, тормозились отсутствием соответствующей в пробирке модель для исследования. Здесь мы описываем начальную мышиный глиальных систему культуры, в которой лечение psychosine результатов в многоядерных микроглии, напоминающих характерные глобоидных клетки, найденные в GLD. Используя эту новую систему, мы определили условия и режимы анализа для изучения глобоидных клеток. Потенциальное использование этой модельной системы была подтверждена в нашем предыдущем исследовании, в котором определены потенциальную роль металлопротеиназы матрикса (ММР) -3 в GLD. Этот роман в пробирке системы может быть полезной модели, в которых исследовано образование и функцию, но и потенциальную лечебные манипуляции, этих уникальных клеток.
Introduction
Глобоидных клеток лейкодистрофия (GLD), известный также как болезнь Краббе, является смертельным заболеванием демиелинизирующая результате потери функциональных мутаций в galatocerebrosidase (Galc) гена 1. Наиболее распространенной формой GLD является инфантильный вариант, который символизируется начала в раннем детстве и характеризуется агрессивным клиническим течением двигателя и снижение когнитивных, ведущей к преждевременной смерти часто до пяти лет 2,3. Генетическое тестирование используется для проверки диагноза GLD 4. Невропатологии из GLD показывает широкое демиелинизации, атрофия нейронов, астроглиоз и присутствие налиты кровью нескольких ядросодержащих микроглии названием глобоидных клетки 5-7. Идентификация глобоидных клеток, часто содержащие tubulous включений в их цитоплазме, был определяющей чертой GLD за последние 97 лет, хотя специфическая функция этих заметных клеток остается неуловимым.
Участие не-MYELinating глии (микроглии и астроциты) в патогенезе GLD уже давно считается вторичным ответом на глубокой демиелинизации при этом заболевании 8. Интересно, что первое описание этого заболевания, сделаны Кнуд Краббе в 1916 5, сообщили образование многоядерных фагоцитов, содержащих липидов мусора, которые были с именем 'глобоидных клетки »и является определяющей характеристикой этой болезни.
Глобоидных клетки являются отличительной чертой особенностью GLD патологии, хотя их роль в GLD уже давно игнорируются. Интересно, что эти клетки являются одними из первых характерных изменений в ЦНС ткани ООВ. Этот недостаток знаний может быть связано с предположением, что образование многоядерных фагоцитов, называемых гигантских клеток в других заболеваний, как правило, рассматривается как следствие патологии, а не начальной патогенного движущей силы 9. Поэтому, было мало исследований, изучающих механизм по WHICH глобоидных клетки образуются из фагоцитов, особенно в ЦНС ООВ. Процедура, описанная в этом отчете основное внимание уделяется важности формирования глобоидных клеток в ЦНС и нашей предыдущей демонстрации, что psychosine вызванной многоядерных микроглии в пробирке и этих клеток выставлены более высокие уровни фагоцитарной активности. В соответствии с этими наблюдениями, глобоидных клетки в мозге Twitcher часто содержат PAS-положительных мусора, предлагая высокий уровень фагоцитарной активности. Глобоидных клетки также установлено, что иммунопозитивных для ферритина (микроглии маркер) 10, КП-1 / CD68 (моноциты маркер), а некоторые также положительны для виментина (белок промежуточных накаливания и маркер астроцитов и активируется микроглии) 11, HLA-DRA (поверхность рецепторов MHCII), и TNF-α 7, и МБА-1 (кальция связывающий белок используется для идентификации микроглии) 12. На основе этой коллекции маркеров, глобоидных клетки происходят из микроглии, которые развиваютсяуникальный фенотип.
Несмотря на их уникальности, специфическая функция и вклад ГК в GLD патогенезе в значительной степени игнорируется. Глобоидных клетки были считается вторичным следствием хронического демиелинизации. Тем не менее, последние исследования, посвященные изучению временную ассоциацию глобоидных клеток белой материи патологии GLD определили присутствие глобоидных клеток в конце эмбрионального к ранних послеродовых периодов; раз предшествующие олигодендроцитов апоптоз и открытой демиелинизацию 13. Таким образом, временная последовательность развития невропатологии в ООВ предполагает, что глобоидных клетки формируются в заранее демиелинизации при этом заболевании 14. Это привело к нашей гипотезе о том, что рано формирование глобоидных клеток в GLD может представлять определяющую патогенную событие, а не вторичной, реактивной ответ на повреждение олигодендроцитов 15. Кроме того, нарушение регуляции микроглии деятельности в GLD был рассмотрен фактог ограничения долгосрочного эффективность hematopeotic терапии стволовыми клетками для лечения этого заболевания 16. Таким образом, исследования клеточных функций и регулирование микроглии и глобоидных клетки, в ответ на psychosine, как ожидается, обеспечит новый взгляд на патогенез GLD.
До недавнего времени, отсутствие соответствующей модели, в которой можно изучать формирование глобоидных клеток не ограничил понимание функции точного и вклад этих клеток в патологии GLD. В недавних исследованиях было установлено, что глобоидных-подобные клетки могут образовываться в качестве прямого ответа на psychosine, патогенную липидный токсин, который накапливается в GLD. Мы обнаружили, что микроглии, но не макрофаги, активируются и превращаются в глобоидных клеток в первичных глиальных культур в ответ на psychosine 15. Это превращение в глобоидных клеток было обнаружено, что при посредничестве внеклеточной протеазы, металлопротеиназы матрикса (ММР) -3 15. Совсем недавно мырасширили эти выводы и решил, что psychosine активированные микроглии и глобоидных клетки, разработанные в этом экстракорпорального модельной системы являются мощно токсичен для олигодендроцитов и клеток олигодендроцитов предшественников. Следовательно, если рассматривать его в контексте GLD, в начале накопления psychosine и формирования глобоидных клеток перед демиелинизации поддержит формирующийся первичный и, возможно, патогенную роль для микроглии при данном заболевании.
Мы предлагаем, что изучение формирования глобоидных клеток откроет новую информацию о патогенезе GLD, что будет способствовать нашему пониманию этого заболевания. Кроме того, этот новый сотовый модель GLD может обеспечить новый формат, из которого новые терапевтические подходы для решения патологические изменения при этом заболевании могут быть проверены. Следовательно, в данном отчете мы предоставляем подробный протокол для развития в пробирке psychosine вызванной глобоидных клеток из первичных культурах не-myelinating глии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанный здесь предоставляет новую модель системы, в которой для изучения развития и функциональные характеристики активированных микроглии и глобоидных клеток. До работы на Im соавт. с использованием клеточной линии HEK293 условии шаблон для разработки настоящего прото?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG 5001-A-3 to S.J.C.), the National Institutes of Health (NS065808 to E.R.B.; NS078392 to S.J.C.), start-up funds from the UConn Health Center (to SJC) and the Kim Family Fund (UCHC in support of K.I.C.).
Materials
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg2+ and Ca2+). | Life technologies | 14175-095 |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi | 130-092-628 |
| 40 uM cell-strainer | Fisherbrand | 22363547 |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg2+ and Ca2+). | Gibco | 14025-092 |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 |
| fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 |
| Penicilin/Streptomycin | Life technologies | 15070-063 |
| Laminin | Sigma | L2020 |
| Trypsin-EDTA solution | Life technologies | 25299-056 |
| Psychosine | Sigma | P9256 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 19208 |
| Normal Goat Serum (NGS) | Invitrogen | PCN5000 |
| Iba-1 | WAKO | 019-19741 |
| Alexa Fluor conjugated antisera | Life Technologies | Various |
| Mounting Media | Southern Biotech | OB100-01 |
| Phagocytic Assay Kit | Cayman Chemicals | 500290 |
| HEPES | Sigma | BP310-500 |
References
- Rafi, M. A., Luzi, P., Chen, Y. Q., Wenger, D. A. A large deletion together with a point mutation in the GALC gene is a common mutant allele in patients with infantile Krabbe disease. Hum Mol Genet. 4, 1285-1289 (1995).
- Duffner, P. K., et al. The long-term outcomes of presymptomatic infants transplanted for Krabbe disease: report of the workshop held on July 11 and 12. Genet Med. 11, 450-454 (2008).
- Duffner, P. K., Jalal, K., Carter, R. L. The Hunter’s Hope Krabbe family database. Pediatr Neurol. 40, 13-18 (2009).
- Duffner, P. K., et al. Newborn screening for Krabbe disease: the New York State model. Pediatr Neurol. 40, 245-252 (2009).
- Krabbe, K. A new familial, infantile form of brain sclerosis. Brain. 39, 74-114 (1916).
- Percy, A. K., Odrezin, G. T., Knowles, P. D., Rouah, E., Armstrong, D. D. Globoid cell leukodystrophy: comparison of neuropathology with magnetic resonance imaging. Acta Neuropathol. 88, 26-32 (1994).
- Itoh, M., et al. Immunohistological study of globoid cell leukodystrophy. Brain Dev. 24, 284-290 (2002).
- Reddy, A. S., Patel, J. R., Vogler, C., Klein, R. S., Sands, M. S. Central nervous system pathology progresses independently of KC and CXCR2 in globoid-cell leukodystrophy. PLoS One. 8, (2013).
- McNally, A. K., Anderson, J. M. Macrophage fusion and multinucleated giant cells of inflammation. Adv Exp Med Biol. 713, 97-111 (2011).
- Kaneko, Y., Kitamoto, T., Tateishi, J., Yamaguchi, K. Ferritin immunohistochemistry as a marker for microglia. Acta Neuropathol. 79, 129-136 (1989).
- Graeber, M. B., Streit, W. J., Kreutzberg, G. W. The microglial cytoskeleton: vimentin is localized within activated cells in situ. J Neurocytol. 17, 573-580 (1988).
- Kondo, Y., Adams, J. M., Vanier, M. T., Duncan, I. D. Macrophages counteract demyelination in a mouse model of globoid cell leukodystrophy. J Neurosci. 31, 3610-3624 (2011).
- Pollanen, M. S., Brody, B. A. Fetal globoid cell leukodystrophy. Arch Pathol Lab Med. 114, 213-216 (1990).
- Martin, J. J., et al. Fetal Krabbe leukodystrophy. A morphologic study of two cases. Acta Neuropathol. 53, 87-91 (1981).
- Ijichi, K., et al. MMP-3 mediates psychosine-induced globoid cell formation: Implications for leukodystrophy pathology. Glia. , (2013).
- Pellegatta, S., et al. The therapeutic potential of neural stem/progenitor cells in murine globoid cell leukodystrophy is conditioned by macrophage/microglia activation. Neurobiol Dis. 21, 314-323 (2006).
- Crocker, S. J., Milner, R., Pham-Mitchell, N., Campbell, I. L. Cell and agonist-specific regulation of genes for matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors by primary glial cells. Journal of Neurochemistry. 98, 812-823 (2006).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. , (2013).
- Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia. Glia. 56, 1187-1198 (2008).
- Moore, C. S., et al. Astrocytic Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 (TIMP-1) Promotes Oligodendrocyte Differentiation and Enhances CNS Myelination. J Neurosci. 31, 6247-6254 (2011).
- Im, D. S., Heise, C. E., Nguyen, T., O’Dowd, B. F., Lynch, K. R. Identification of a molecular target of psychosine and its role in globoid cell formation. J Cell Biol. 153, 429-434 (2001).
