Bir<em> İn Vitro</em> Globoid Hücre lökodistrofi Hücresel Patofizyoloji Çalışması Modeli
Summary
Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.
Abstract
Globoid hücre lökodistrofi (GLD) merkezi sinir sisteminde benzersiz bol miktarda globoid hücreler olarak adlandırılan, çok-çekirdekli mikroglia işlevi tam, açık değildir. Bilginin bu boşluk çalışma için bir in vitro model uygun olmaması ile engellenmiştir. Bu yazıda, bir ilköğretim kemirgen glial kültür sistemi açıklanmaktadır GLD bulunan karakteristik globoid hücrelerini andıran mikroglianın multinükleasyon içinde psychosine sonuçları ile hangi tedavi olarak. Bu roman sistemi kullanarak, biz globoid hücrelerin çalışması için koşulları ve analiz modları tanımlanır. Bu model sisteminin potansiyel kullanım matriks metalloproteinaz (MMP) için potansiyel bir rol tespit önceki çalışmamızda, geçerliliği -3 GLD içinde. Vitro sistemde bu yeni bu eşsiz hücrelerin oluşumu ve işlevi, hem de potansiyel tedavi edici işleme, çalışılacak yararlı bir model olabilir.
Introduction
Ayrıca, Krabbe hastalığı olarak da bilinir globoid hücre lökodistrofi (MP), galatocerebrosidase (galc) geni 1 mutasyonlar işlev kaybı olmasından kaynaklanan öldürücü bir demiyeline eden bir hastalıktır. GLD en yaygın şekli, erken çocukluk döneminde başlayan verebiliriz ve genellikle yaş 2,3 beş yaşından önce motor ve erken ölüme yol açan bilişsel gerileme agresif bir klinik seyri ile karakterizedir infantil çeşididir. Genetik test GLD 4 tanısını doğrulamak için kullanılır. GLD Nöropatoloji globoid hücreler 5-7 adlandırılan yaygın demiyelinasyon, nöronal atrofi, ve astrogliyozun tıkanmış çok çekirdekli mikroglia varlığını ortaya koymaktadır. Bu göze çarpan hücrelerinin spesifik işlevi belirsiz kalmıştır rağmen bunların sitoplazmalarında tubulous inklüzyonları içeren globoid hücrelerin tanımlanması, son 97 yıldır GLD belirleyici bir özelliğidir.
Olmayan MYEL katılımlarıGLD patogenezinde bertaraf eder glial (mikroglia ve astrositler) bu kadar uzun süre hastalık 8 derin demiyelinasyon ikincil yanıt olarak kabul edilmiştir. İlginçtir, 1916 5 Knud Krabbe tarafından yapılan bu hastalığın ilk açıklama, adını almış lipit enkaz içeren çok çekirdekli fagositlerin bildirdi oluşumu 'hücreleri GLOBOID' ve bu hastalığın belirleyici bir özelliği vardır.
GLD rollerini uzun ihmal edilmiş olsa Globoid hücreleri, GLD patoloji damgasını özelliğidir. İlginç bir şekilde, bu hücreler GLD CNS dokusunun bir erken karakteristik değişikliklere arasındadır. Bu bilgi eksikliği nedeniyle çok çekirdekli fagositler, diğer hastalıklar olarak adlandırılan dev hücrelerin oluşumu, tipik olarak, bir ilk patojenik itici gücü 9 daha patoloji sonucu olarak kabul edilir olduğu varsayımına olabilir. Bu nedenle, WHI tarafından mekanizmasını araştıran az sayıda çalışma vardırkanal globoid hücreleri özellikle GLD CNS'de, fagositoz oluşturulur. Bu raporda açıklanan prosedür CNS'de globoid hücre formasyonunun önemi ve fagositik aktivite daha yüksek seviyede sergilediği in vitro mikroglia ve bu hücrelerin bu psychosine kaynaklı multinükleasyon önceki gösteri odaklanmaktadır. Bu gözlemlerle tutarlı olarak, titrek beyinlerinde globoid fagositik hücreleri sıklıkla yüksek düzeyde aktivite gösteren, PAS pozitif kalıntı içermektedir. Globoid hücreler de ferritin için immünopozitif bulunmuştur (Mikroglia işaretleyici) 10, KP-1 / CD68 (bir monosit işaretleyici), ve biraz da vimentin için pozitif (bir ara filament proteini ve astrositlerde işaretleyici ve aktif mikroglia) 11, HLA DRA (MHC II bir yüzey reseptörü) ve TNF-α 7 ve IBA-1 12 (mikroglia tanımlamak için kullanılan bir kalsiyum bağlayıcı protein). Belirteçlerin bu koleksiyon dayanarak, globoid hücreleri geliştirmek mikrogliada kaynaklananeşsiz bir fenotip.
Onların teklik rağmen, belirli bir işlevi ve GLD patogeneze GClerin katkısı büyük ölçüde gözardı edilmiştir. Globoid hücreleri kronik bir demyelinizasyon ikincil sonucu olarak düşünülmektedir. Ancak, GLD beyaz cevher patoloji globoid hücrelerin zamansal ilişkiyi ele geçmiş çalışmaların erken doğum sonrası dönemlere geç embriyonik içinde globoid hücrelerin varlığını tespit ettik; olgodendrosit apoptoz ve aleni demiyelinizasyonu 13 önceki kez. Böylece gld içinde nöropatolojinin gelişme zamansal dizisi globoid hücreleri bu hastalığın 14 demyelinasyon önceden oluşturulmuş olduğunu göstermektedir. Bu GLD içinde globoid hücrelerin erken oluşumu olgodendrosit hasar 15 ikincil reaktif tepki yerine tanımlayan bir patojenik olayı temsil edebilir bizim hipoteze. Ayrıca, GLD mikrogliyal aktivite düzensizliği facto bir kabul edilmiştirR, bu hastalığın tedavi edilmesi için 16 hematopeotic kök hücre tedavilerinin uzun vadeli etkisini azaltır. Böylece, psychosine yanıt hücresel fonksiyonları ve mikroglianın düzenleme ve globoid hücreleri, soruşturma GLD patogenezinde yeni anlayışlar sağlaması bekleniyor.
Yakın zamana kadar, globoid hücre oluşumunu incelemek için uygun bir modelin eksikliği kesin fonksiyonu ve GLD patolojiye bu hücrelerin katkı anlayış olamadı. Son zamanlarda yapılan araştırmalarda, bu globoid benzeri hücreler gld biriken patojenik toksin lipit psychosine doğrudan tepki olarak oluşturulabilir olduğu belirlenmiştir. O mikroglia değil, ancak makrofajlar, aktive edilmiş ve 15 psychosine karşılık olarak birincil kültürde globoid glial hücrelere transforme edilir. Globoid hücrelere Bu dönüşüm, hücre dışı proteaz, matris metaloproteinaz (MMP) -3 15 aracılık ettiği bulunmuştur. Daha yakın zamanlarda,Bu in vitro model sisteminde geliştirilen psychosine-aktif mikroglia ve globoid hücreler genişletilmiş ve bu bulguları belirledikten oligodendrosit ve oligodendrosit projenitör hücreler için potansiyel olarak toksik değildir. Bu nedenle, GLD, psychosine ve bu hastalıkta mikroglia için, ortaya çıkan ilk ve muhtemelen patojenik bir rol destekleyecektir demiyelinasyon önce globoid hücrelerinin oluşumunun erken birikimi bağlamında dikkati çekmektedir.
Biz bu hastalığın anlaşılmasına katkıda bulunacaktır GLD patogenezi hakkında yeni bilgiler ortaya çıkacaktır globoid hücresi oluşumu bu çalışmayı öneriyorum. Dahası, GLD bu yeni hücresel modelin yeni tedavi yaklaşımları, bu hastalığın patolojik değişiklikler test edilebilir hitap hangi yeni bir biçimi sağlayabilir. Bu nedenle, bu raporda non-myelinating glia primer kültürlerinde psychosine kaynaklı globoid hücrelerinin in vitro olarak geliştirilmesi için ayrıntılı bir protokol sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada tarif edilen protokol geliştirilmesi ve aktif mikroglia ve globoid hücrelerin fonksiyonel karakterizasyonu incelemek için olan yeni bir model sistemi sağlar. Im ve arkadaşları tarafından önceki iş. Bir HEK293 hücre hattı kullanılarak globoid hücre oluşumu 21 çalışma için mevcut protokol geliştirilmesi için bir şablon sağladı. Bu modelde elde edilen hücreler globoid GLD tanımlanabilir doğal globoid hücrelerden farklı olduğuna işaret etmek de önemlidir. GLD yılın…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG 5001-A-3 to S.J.C.), the National Institutes of Health (NS065808 to E.R.B.; NS078392 to S.J.C.), start-up funds from the UConn Health Center (to SJC) and the Kim Family Fund (UCHC in support of K.I.C.).
Materials
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg2+ and Ca2+). | Life technologies | 14175-095 |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi | 130-092-628 |
| 40 uM cell-strainer | Fisherbrand | 22363547 |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg2+ and Ca2+). | Gibco | 14025-092 |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 |
| fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 |
| Penicilin/Streptomycin | Life technologies | 15070-063 |
| Laminin | Sigma | L2020 |
| Trypsin-EDTA solution | Life technologies | 25299-056 |
| Psychosine | Sigma | P9256 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 19208 |
| Normal Goat Serum (NGS) | Invitrogen | PCN5000 |
| Iba-1 | WAKO | 019-19741 |
| Alexa Fluor conjugated antisera | Life Technologies | Various |
| Mounting Media | Southern Biotech | OB100-01 |
| Phagocytic Assay Kit | Cayman Chemicals | 500290 |
| HEPES | Sigma | BP310-500 |
References
- Rafi, M. A., Luzi, P., Chen, Y. Q., Wenger, D. A. A large deletion together with a point mutation in the GALC gene is a common mutant allele in patients with infantile Krabbe disease. Hum Mol Genet. 4, 1285-1289 (1995).
- Duffner, P. K., et al. The long-term outcomes of presymptomatic infants transplanted for Krabbe disease: report of the workshop held on July 11 and 12. Genet Med. 11, 450-454 (2008).
- Duffner, P. K., Jalal, K., Carter, R. L. The Hunter’s Hope Krabbe family database. Pediatr Neurol. 40, 13-18 (2009).
- Duffner, P. K., et al. Newborn screening for Krabbe disease: the New York State model. Pediatr Neurol. 40, 245-252 (2009).
- Krabbe, K. A new familial, infantile form of brain sclerosis. Brain. 39, 74-114 (1916).
- Percy, A. K., Odrezin, G. T., Knowles, P. D., Rouah, E., Armstrong, D. D. Globoid cell leukodystrophy: comparison of neuropathology with magnetic resonance imaging. Acta Neuropathol. 88, 26-32 (1994).
- Itoh, M., et al. Immunohistological study of globoid cell leukodystrophy. Brain Dev. 24, 284-290 (2002).
- Reddy, A. S., Patel, J. R., Vogler, C., Klein, R. S., Sands, M. S. Central nervous system pathology progresses independently of KC and CXCR2 in globoid-cell leukodystrophy. PLoS One. 8, (2013).
- McNally, A. K., Anderson, J. M. Macrophage fusion and multinucleated giant cells of inflammation. Adv Exp Med Biol. 713, 97-111 (2011).
- Kaneko, Y., Kitamoto, T., Tateishi, J., Yamaguchi, K. Ferritin immunohistochemistry as a marker for microglia. Acta Neuropathol. 79, 129-136 (1989).
- Graeber, M. B., Streit, W. J., Kreutzberg, G. W. The microglial cytoskeleton: vimentin is localized within activated cells in situ. J Neurocytol. 17, 573-580 (1988).
- Kondo, Y., Adams, J. M., Vanier, M. T., Duncan, I. D. Macrophages counteract demyelination in a mouse model of globoid cell leukodystrophy. J Neurosci. 31, 3610-3624 (2011).
- Pollanen, M. S., Brody, B. A. Fetal globoid cell leukodystrophy. Arch Pathol Lab Med. 114, 213-216 (1990).
- Martin, J. J., et al. Fetal Krabbe leukodystrophy. A morphologic study of two cases. Acta Neuropathol. 53, 87-91 (1981).
- Ijichi, K., et al. MMP-3 mediates psychosine-induced globoid cell formation: Implications for leukodystrophy pathology. Glia. , (2013).
- Pellegatta, S., et al. The therapeutic potential of neural stem/progenitor cells in murine globoid cell leukodystrophy is conditioned by macrophage/microglia activation. Neurobiol Dis. 21, 314-323 (2006).
- Crocker, S. J., Milner, R., Pham-Mitchell, N., Campbell, I. L. Cell and agonist-specific regulation of genes for matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors by primary glial cells. Journal of Neurochemistry. 98, 812-823 (2006).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. , (2013).
- Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia. Glia. 56, 1187-1198 (2008).
- Moore, C. S., et al. Astrocytic Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 (TIMP-1) Promotes Oligodendrocyte Differentiation and Enhances CNS Myelination. J Neurosci. 31, 6247-6254 (2011).
- Im, D. S., Heise, C. E., Nguyen, T., O’Dowd, B. F., Lynch, K. R. Identification of a molecular target of psychosine and its role in globoid cell formation. J Cell Biol. 153, 429-434 (2001).
