Un<em> In Vitro</em> Modèle pour l'étude de la physiopathologie cellulaire en cellules globoïdes Leucodystrophie
Summary
Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.
Abstract
La fonction précise de la microglie multi-nucléées, appelées cellules globoïdes, qui sont uniquement abondant dans le système nerveux central de la leucodystrophie à cellules globoïdes (GLD) n'est pas claire. Cette lacune dans les connaissances a été entravée par l'absence d'un modèle in vitro approprié pour l'étude. Nous décrivons ici un système de culture primaire gliale de souris dans lesquelles un traitement avec des résultats psychosine multinucléation de la microglie ressemblant aux cellules globoïdes caractéristiques trouvées dans GLD. L'utilisation de ce nouveau système, nous avons défini les conditions et les modes d'analyse pour l'étude des cellules globoïdes. L'utilisation potentielle de ce système modèle a été validé dans notre précédente étude, qui a identifié le rôle potentiel de la métalloprotéinase matricielle (MMP) -3 GLD. Ce roman système in vitro peut être un modèle utile pour l'étude de la formation et de la fonction, mais aussi la manipulation thérapeutique potentielle, de ces cellules uniques.
Introduction
Leucodystrophie à cellules globoïdes (GLD), également connue comme la maladie de Krabbe, est une maladie démyélinisante mortelle résultant de la perte de mutations de fonction dans le galatocerebrosidase (GalC) une gène. La forme la plus répandue de GLD est la variante infantile qui est caractérisée par l'apparition de la petite enfance et se caractérise par une évolution clinique agressive de moteur et le déclin cognitif conduisant à la mort prématurée souvent avant cinq ans de 2,3 ans. Les tests génétiques sont utilisés pour vérifier un diagnostic de GLD 4. Neuropathologie de GLD révèle démyélinisation répandue, l'atrophie neuronale, astrogliose et la présence de la microglie multi-nucléées engorgés appelé cellules globoïdes 5-7. L'identification des cellules globoïdes, contenant souvent des inclusions tubuleuses dans leur cytoplasme, a été un élément déterminant de GLD pour les 97 dernières années, bien que la fonction spécifique de ces cellules visibles est resté inaccessible.
La participation des non-MYELnaires gliales (astrocytes) et la microglie dans la pathogenèse de GLD a longtemps été considéré comme une réponse secondaire à la démyélinisation profonde dans cette maladie 8. Fait intéressant, la première description de cette maladie, faite par Knud Krabbe en 1916 5, la formation rapporté des phagocytes multinucléées contenant des débris de lipides qui ont été nommé «cellules globoïdes» et sont l'une des caractéristiques de cette maladie.
Cellules globoïdes sont le symptôme caractéristique de GLD pathologie, bien que leur rôle dans la GLD a longtemps été ignorée. Fait intéressant, ces cellules sont parmi les premiers changements caractéristiques dans les tissus du système nerveux central de GLD. Ce manque de connaissances peut être dû à l'hypothèse que la formation des phagocytes multinucléées, appelées cellules géantes dans d'autres maladies, sont généralement considérée comme une conséquence de la pathologie plutôt qu'une force motrice pathogène initial 9. Par conséquent, il ya eu peu d'études du mécanisme par whicellules globoïdes ch sont formées à partir des phagocytes, en particulier dans le système nerveux central de GLD. La procédure décrite dans le présent rapport met l'accent sur l'importance de la formation des cellules globoïdes dans le SNC et notre démonstration précédente que de multinucléation induite psychosine-des microglies in vitro et ces cellules ont un sens élevé de l'activité phagocytaire. En accord avec ces observations, les cellules globoïdes dans le cerveau twitcher contiennent souvent des débris de PAS-positif, suggérant des niveaux élevés de l'activité phagocytaire. Cellules globoïdes sont également avérés immunopositif pour la ferritine (un marqueur de la microglie) 10, KP-1 / CD68 (un marqueur des monocytes), et certains sont également positives pour la vimentine (une protéine intermédiaire du filament et un marqueur des astrocytes et la microglie activée) 11, HLA-DRA (un récepteur de surface MHCII), le TNF-α et 7, et Iba-1 (une protéine de liaison de calcium utilisé pour identifier les cellules microgliales) 12. Sur la base de cette collection de marqueurs, les cellules globoïdes proviennent de la microglie qui se développentun phénotype unique.
En dépit de leur caractère unique, la fonction spécifique et la contribution de GC à GLD pathogenèse a été largement négligé. Cellules globoïdes ont été pensé pour être une conséquence secondaire de démyélinisation chronique. Toutefois, des études antérieures portant sur le lien temporel de cellules globoïdes à la question pathologie blanc de GLD ont identifié la présence de cellules globoïdes à la fin du embryonnaire à la période postnatale précoce; fois précédentes oligodendrocytes apoptose et une démyélinisation manifeste 13. Ainsi, la séquence temporelle de développement de la neuropathologie dans GLD suggère que les cellules globoïdes sont formés à l'avance de la démyélinisation dans la maladie 14. Cela a conduit à notre hypothèse que la formation précoce des cellules globoïdes dans GLD peut représenter un événement pathogène plutôt que de définir une réponse réactive secondaire à des lésions des oligodendrocytes 15. En outre, la dérégulation de l'activité de la microglie dans GLD a été considéré comme un faitr limitant l'efficacité à long terme des thérapies de cellules souches hematopeotic pour le traitement de cette maladie 16. Ainsi, l'étude des fonctions cellulaires et la régulation de la microglie et les cellules globoïdes, en réponse à psychosine devrait fournir de nouvelles perspectives dans la pathogenèse de GLD.
Jusqu'à récemment, l'absence d'un modèle approprié pour étudier la formation des cellules globoïdes avait limité la compréhension de la fonction précise et la contribution de ces cellules à la pathologie de la GLD. Dans des études récentes, il a été déterminé que les cellules globoïdes analogue peuvent être formées en réponse directe à la psychosine, une toxine pathogène lipidique qui s'accumule dans GLD. Nous avons constaté que la microglie, des macrophages, mais non, sont activés et transformés dans des cellules globoïdes dans les cultures gliales primaires en réponse à psychosine 15. Cette transformation en cellules globoïdes a été trouvé pour être médiée par la protéase extracellulaire, la matrice métalloprotéinase (MMP) -3 15. Plus récemment, nousont étendu ces résultats et déterminé que les cellules de la microglie et globoïdes psychosine activé développés dans ce système in vitro de modèle sont puissamment toxique pour les oligodendrocytes et les cellules progénitrices oligodendrocytes. Par conséquent, lorsqu'il est considéré dans le contexte de GLD, l'accumulation rapide de psychosine et la formation de cellules globoïdes avant démyélinisation appuierait un rôle principal et éventuellement pathogène émergent de la microglie dans cette maladie.
Nous proposons que l'étude de la formation des cellules globoïde va révéler de nouvelles informations sur la pathogenèse de GLD qui contribuera à notre compréhension de cette maladie. En outre, ce nouveau modèle cellulaire de GLD peut fournir un nouveau format à partir de laquelle de nouvelles approches thérapeutiques pour traiter des changements pathologiques dans cette maladie pourraient être testés. Par conséquent, dans ce rapport, nous proposons un protocole détaillé pour le développement in vitro de cellules globoïdes induite psychosine-de cultures primaires de cellules gliales non-myélinisation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici fournit un nouveau système modèle pour étudier le développement et la caractérisation fonctionnelle de la microglie et les cellules activées globoïdes. Des travaux antérieurs par Im et al. en utilisant une lignée cellulaire HEK293 a fourni un modèle pour le développement du présent Protocole pour l'étude de la formation des cellules globoïde 21. Il est également important de souligner que les cellules globoïdes dérivés dans le modèle diffèrent des cell…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG 5001-A-3 to S.J.C.), the National Institutes of Health (NS065808 to E.R.B.; NS078392 to S.J.C.), start-up funds from the UConn Health Center (to SJC) and the Kim Family Fund (UCHC in support of K.I.C.).
Materials
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg2+ and Ca2+). | Life technologies | 14175-095 |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi | 130-092-628 |
| 40 uM cell-strainer | Fisherbrand | 22363547 |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg2+ and Ca2+). | Gibco | 14025-092 |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 |
| fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 |
| Penicilin/Streptomycin | Life technologies | 15070-063 |
| Laminin | Sigma | L2020 |
| Trypsin-EDTA solution | Life technologies | 25299-056 |
| Psychosine | Sigma | P9256 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 19208 |
| Normal Goat Serum (NGS) | Invitrogen | PCN5000 |
| Iba-1 | WAKO | 019-19741 |
| Alexa Fluor conjugated antisera | Life Technologies | Various |
| Mounting Media | Southern Biotech | OB100-01 |
| Phagocytic Assay Kit | Cayman Chemicals | 500290 |
| HEPES | Sigma | BP310-500 |
References
- Rafi, M. A., Luzi, P., Chen, Y. Q., Wenger, D. A. A large deletion together with a point mutation in the GALC gene is a common mutant allele in patients with infantile Krabbe disease. Hum Mol Genet. 4, 1285-1289 (1995).
- Duffner, P. K., et al. The long-term outcomes of presymptomatic infants transplanted for Krabbe disease: report of the workshop held on July 11 and 12. Genet Med. 11, 450-454 (2008).
- Duffner, P. K., Jalal, K., Carter, R. L. The Hunter’s Hope Krabbe family database. Pediatr Neurol. 40, 13-18 (2009).
- Duffner, P. K., et al. Newborn screening for Krabbe disease: the New York State model. Pediatr Neurol. 40, 245-252 (2009).
- Krabbe, K. A new familial, infantile form of brain sclerosis. Brain. 39, 74-114 (1916).
- Percy, A. K., Odrezin, G. T., Knowles, P. D., Rouah, E., Armstrong, D. D. Globoid cell leukodystrophy: comparison of neuropathology with magnetic resonance imaging. Acta Neuropathol. 88, 26-32 (1994).
- Itoh, M., et al. Immunohistological study of globoid cell leukodystrophy. Brain Dev. 24, 284-290 (2002).
- Reddy, A. S., Patel, J. R., Vogler, C., Klein, R. S., Sands, M. S. Central nervous system pathology progresses independently of KC and CXCR2 in globoid-cell leukodystrophy. PLoS One. 8, (2013).
- McNally, A. K., Anderson, J. M. Macrophage fusion and multinucleated giant cells of inflammation. Adv Exp Med Biol. 713, 97-111 (2011).
- Kaneko, Y., Kitamoto, T., Tateishi, J., Yamaguchi, K. Ferritin immunohistochemistry as a marker for microglia. Acta Neuropathol. 79, 129-136 (1989).
- Graeber, M. B., Streit, W. J., Kreutzberg, G. W. The microglial cytoskeleton: vimentin is localized within activated cells in situ. J Neurocytol. 17, 573-580 (1988).
- Kondo, Y., Adams, J. M., Vanier, M. T., Duncan, I. D. Macrophages counteract demyelination in a mouse model of globoid cell leukodystrophy. J Neurosci. 31, 3610-3624 (2011).
- Pollanen, M. S., Brody, B. A. Fetal globoid cell leukodystrophy. Arch Pathol Lab Med. 114, 213-216 (1990).
- Martin, J. J., et al. Fetal Krabbe leukodystrophy. A morphologic study of two cases. Acta Neuropathol. 53, 87-91 (1981).
- Ijichi, K., et al. MMP-3 mediates psychosine-induced globoid cell formation: Implications for leukodystrophy pathology. Glia. , (2013).
- Pellegatta, S., et al. The therapeutic potential of neural stem/progenitor cells in murine globoid cell leukodystrophy is conditioned by macrophage/microglia activation. Neurobiol Dis. 21, 314-323 (2006).
- Crocker, S. J., Milner, R., Pham-Mitchell, N., Campbell, I. L. Cell and agonist-specific regulation of genes for matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors by primary glial cells. Journal of Neurochemistry. 98, 812-823 (2006).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. , (2013).
- Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia. Glia. 56, 1187-1198 (2008).
- Moore, C. S., et al. Astrocytic Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 (TIMP-1) Promotes Oligodendrocyte Differentiation and Enhances CNS Myelination. J Neurosci. 31, 6247-6254 (2011).
- Im, D. S., Heise, C. E., Nguyen, T., O’Dowd, B. F., Lynch, K. R. Identification of a molecular target of psychosine and its role in globoid cell formation. J Cell Biol. 153, 429-434 (2001).
