一<em>在体外</em>模型细胞病理生理学的球细胞脑白质营养不良的研究
Summary
Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.
Abstract
多成核的小神经胶质细胞的确切功能，称为球状的细胞，即是在球状细胞脑白质营养不良（GLD）的中枢神经系统中唯一地丰富目前还不清楚。在认识这个差距已经阻碍了缺乏适当的体外研究模型。在这里，我们描述了一个主要的鼠神经胶质培养体系中，治疗psychosine结果在小神经胶质细胞的多核类似GLD中发现的特征球状细胞。使用这个新系统，我们定义的条件和分析模式弧面细胞的研究。可能利用此模型系统在我们以前的研究，其中确定了基质金属蛋白酶（MMP）的潜在作用进行了验证-3 GLD。这种新颖的体外系统可以是其中以研究这些独特的细胞的形成和功能，而且还潜在治疗操纵，一个有用的模型。
Introduction
球细胞脑白质营养不良（GLD），也被称为克拉伯病，是一种致命的脱髓鞘疾病的功能突变的galatocerebrosidase（GALC）1基因造成的损失。政府物流服务署的最普遍的形式是由发生在儿童早期代表，往往前五年2,3岁特点是运动和认知能力下降，导致过早死亡的一个积极的临床过程中，婴儿的变体。基因检测是用来验证GLD 4的诊断。政府物流服务署的神经病理学发现广泛脱髓鞘，神经萎缩，星形胶质细胞增生和肿胀多有核小胶质细胞的存在被称为球状细胞5-7。弧面细胞的鉴定，常含在细胞质筒状包裹体，一直是政府物流服务署的定义特征，在过去97年虽然这些显眼细胞的特异功能一直难以实现。
非MYEL的参与GLD中的发病inating神经胶质细胞（小胶质细胞和星形胶质细胞），一直被认为是本病8到深刻的脱髓鞘二级响应。有趣的是，这种疾病的最初描述，在1916年5由克努兹克拉贝，包含已命名的脂质碎片多核巨噬细胞的报道形成“球状细胞'并且是本病的决定性特征。
球状细胞病理学（GLD）的共同特征，虽然他们在政府物流服务署的角色长期以来被忽视了。有趣的是，这些细胞中，GLD的CNS组织中的最早的特性的变化。这种知识的缺乏可能是由于该多核巨噬细胞，称为巨核细胞中的其他疾病的形成中，通常认为是病理学的结果，而不是一个初始致病驱动力9的假设。因此，很少有研究调查了WHI机制CH弧面细胞是从吞噬细胞形成，特别是在政府物流服务署的中枢神经系统。本报告中所述的程序集中于球细胞的形成在CNS中的重要性和我们先前示范体外小胶质细胞以及这些细胞的那psychosine诱导的多核化表现出较高水平的细胞吞噬活性的。根据这些意见，球状细胞鸟类观察者的大脑经常含有PAS阳性的碎片，暗示高水平的吞噬活性。球状细胞也发现免疫阳性铁蛋白（一小胶质细胞标记物）10，KP-1 / CD68（单核细胞标记物），有的还积极为波形蛋白（一种中间丝蛋白，星形胶质细胞的标志物和激活的小胶质细胞），11， HLA-DRA（一个MHCII表面受体），和TNF-α7和IBA-112（用于识别的小胶质细胞钙结合蛋白）。基于标记这个集合，球状细胞从培养小胶质细胞起源独特的表型。
尽管他们的独特性，具体功能和选区于GLD发病的贡献已经在很大程度上被忽视。球状细胞已被认为是慢性脱髓鞘的次要结果。然而，过去的研究探讨球状细胞的时序关联到政府物流服务署的脑白质病变已经确定球状细胞在胚胎后期存在于出生后早期阶段;时间少突胶质细胞凋亡和公开脱髓鞘13前。因此，在GLD的神经病理学发展的时间顺序显示，球状细胞形成预先脱髓鞘在此疾病14。这导致我们在GLD早期形成球状的细胞可能代表一个决定性致病事件，而不是次要的，反应要少突胶质细胞受损15回应假设。此外，在政府物流服务署小胶质细胞活性的失调也被认为是事实上的R限流的hematopeotic干细胞疗法的远期疗效治疗本病16。因此，调查的细胞功能和小胶质细胞的调节，球状的细胞，以应对psychosine预计将提供在政府物流服务署的发病机制的新见解。
直到最近，缺乏在其中，研究球状细胞形成一个合适的模型已经限定的确切功能及这些细胞GLD的病理作用的了解。在最近的研究中，确定该弧面状细胞可被形成在直接响应psychosine，积聚在GLD病原脂质毒素。我们发现，小胶质细胞，但不巨噬细胞，被激活并转化成球状的细胞在初级胶质细胞培养响应于psychosine 15。该转化成球状的细胞被发现的胞外蛋白酶，基质金属蛋白酶（MMP）-3 15介导。最近，我们扩展了这些调查结果，并决定在此体外模型系统，开发出psychosine激活的小胶质细胞和球状细胞强效有毒的少突胶质细胞和少突胶质祖细胞。因此，当在GLD，psychosine和地层之前脱髓鞘将支持在该疾病的小胶质细胞的新兴初级和可能的致病作用弧面细胞的早期积累的上下文中考虑。
我们建议的球细胞形成的研究将揭示政府物流服务署的发病机制，这将有助于我们对这个疾病的认识新的信息。此外，政府物流服务署对这种新的细胞模型可提供一种新的形式从中新的治疗方法，以解决这种疾病的病理变化可以进行测试。因此，在本报告中，我们提供了体外发育非髓鞘神经胶质细胞的原代培养psychosine诱发球状细胞的详细协议。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里所描述的协议提供了一种新的模式系统，其中研究开发和激活小胶质细胞和球状细胞的功能特性。通过QQ，MSN 等前期工作。使用HEK293细胞系提供本协议的发展为球细胞形成21学习的模板。同样重要的是要指出，来自在该模型中的球状细胞来自原弧面细胞识别在GLD不同。举例来说，我们经常观察到小神经胶质细胞在我们的鼠文化quadranucleation，而球状细胞（GLD）经常被发现含有超?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG 5001-A-3 to S.J.C.), the National Institutes of Health (NS065808 to E.R.B.; NS078392 to S.J.C.), start-up funds from the UConn Health Center (to SJC) and the Kim Family Fund (UCHC in support of K.I.C.).
Materials
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg2+ and Ca2+). | Life technologies | 14175-095 |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi | 130-092-628 |
| 40 uM cell-strainer | Fisherbrand | 22363547 |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg2+ and Ca2+). | Gibco | 14025-092 |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 |
| fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 |
| Penicilin/Streptomycin | Life technologies | 15070-063 |
| Laminin | Sigma | L2020 |
| Trypsin-EDTA solution | Life technologies | 25299-056 |
| Psychosine | Sigma | P9256 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 19208 |
| Normal Goat Serum (NGS) | Invitrogen | PCN5000 |
| Iba-1 | WAKO | 019-19741 |
| Alexa Fluor conjugated antisera | Life Technologies | Various |
| Mounting Media | Southern Biotech | OB100-01 |
| Phagocytic Assay Kit | Cayman Chemicals | 500290 |
| HEPES | Sigma | BP310-500 |
References
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