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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

में माइलॉयड कोशिकाओं गतिशीलता की वास्तविक समय इमेजिंग Published: October 6, 2014 doi: 10.3791/51916
Automatic Translation
*1,2, *2, 2
1Department of Oncology, INSERM U661, Functional Genomic Institute, 2Department of Anatomy, University of California
* These authors contributed equally

Abstract

माइलॉयड कोशिकाओं ट्यूमर के भीतर सबसे प्रचुर मात्रा में प्रतिरक्षा कोशिकाओं रहे हैं और ट्यूमर प्रगति को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है. आधुनिक intravital इमेजिंग तकनीक अंग अंदर रहते सेलुलर व्यवहार का प्रेक्षण सक्षम है लेकिन इस तरह के आंत के रूप में होने के कारण अंग और ट्यूमर पहुंच कैंसर के कुछ प्रकारों में चुनौतीपूर्ण हो सकता है. आंतों ट्यूमर का प्रत्यक्ष अवलोकन जैसा कि पहले बताया नहीं गया है. यहाँ वर्णित एक शल्य प्रक्रिया ट्रांसजेनिक फ्लोरोसेंट संवाददाता चूहों और इंजेक्शन tracers या एंटीबॉडी का उपयोग करके जीवित चूहों में ट्यूमर आंतों के भीतर माइलॉयड सेल गतिशीलता का प्रत्यक्ष अवलोकन की अनुमति देता है. इस प्रयोजन के लिए तेजी से छवि अधिग्रहण के साथ लंबे समय तक निरंतर इमेजिंग की अनुमति देता है कि एक चार रंग, बहु क्षेत्र, सूक्ष्म lensed कताई डिस्क confocal खुर्दबीन इस्तेमाल किया गया है. पार कर रहे हैं छोटी आंत में कई adenomas कि विकसित Apc न्यूनतम / + चूहों माइलॉयड कोशिकाओं कल्पना करने के लिए C-FMS-EGFP चूहों के साथ और ACTB-ECFP चूहों के साथतहखाने की आंतों उपकला कोशिकाओं कल्पना करने के लिए. इस तरह के रक्त वाहिकाओं और neutrophils, और serosal सतह के माध्यम से इमेजिंग के लिए ट्यूमर स्थिति के लिए प्रक्रिया के रूप में विभिन्न ट्यूमर घटकों, लेबलिंग के लिए प्रक्रियाओं को भी वर्णित हैं. इमेजिंग के कई घंटे से संकलित समय चूक फिल्मों आंतों microenvironment में सीटू माइलॉयड सेल व्यवहार का विश्लेषण अनुमति देते हैं.

Introduction

भारी सबूत अब fibroblasts, endothelial कोशिकाओं, प्रतिरक्षा और भड़काऊ कोशिकाओं, बाह्य मैट्रिक्स, और घुलनशील कारकों सहित विषम सेल आबादी, से मिलकर ट्यूमर microenvironment, लगभग सभी को योगदान करके दीक्षा और ठोस ट्यूमर की प्रगति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है कि यह दर्शाता है कैंसर 1 की पहचान. दरअसल, ट्यूमर प्रगति के दौरान, दुष्टता 2 के लिए अनुकूल एक microenvironment उत्पन्न करने के लिए विकसित उस तब्दील कैंसर कोशिकाओं और stromal कोशिकाओं के बीच निरंतर गतिशील बातचीत कर रहे हैं. ट्यूमर microenvironment घुसपैठ कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अलावा, माइलॉयड कोशिकाओं 3 सबसे प्रचुर मात्रा में हैं. (टीएएम) ट्यूमर जुड़े मैक्रोफेज से मिलकर, माइलॉयड व्युत्पन्न दबानेवाला कोशिकाओं (MDSCs), वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) और neutrophils (PMNs), माइलॉयड कोशिकाओं अस्थि मज्जा से भर्ती कर रहे हैं और उत्तरोत्तर साइटोकिन्स, वृद्धि कारक है और proteases जो जारी करने, ट्यूमर घुसपैठ प्रचार कर सकते हैंट्यूमर के विकास और 4 फैल गया. कैंसर की कोशिकाओं और माइलॉयड कोशिकाओं के बीच crosstalk जटिल लेकिन गतिशील है. इस प्रकार उनकी बातचीत की प्रकृति को समझने के लिए इन कोशिकाओं के बजाय एक विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में भाग लेने के कैंसर की प्रगति को बढ़ावा देने के लिए क्यों निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है, और इसे नियंत्रित करने के लिए नए लक्ष्य को खोजने के लिए मदद मिल सकती है.

Intravital माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रत्यक्ष अवलोकन लाइव चूहों 5 के ऊतकों के भीतर सेल गतिशीलता पर जानकारी प्रदान करता है. एक चार रंग, बहु क्षेत्र, सूक्ष्म lensed कताई डिस्क confocal प्रणाली स्तन ट्यूमर 6 भीतर stromal कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए डिजाइन किया गया था. यह दृष्टिकोण लंबे समय तक निरंतर इमेजिंग सक्षम बनाता है और इस तरह के प्रस्ताव कलाकृतियों को कम करने के लिए (एक) तेजी से छवियों अधिग्रहण, (ख) दीर्घकालिक संज्ञाहरण, (ग) विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं का पालन करने के लिए चार रंग अधिग्रहण, (घ) फ्लोरोसेंट लेबलिंग के रूप में कई फायदे भी शामिल के विभिन्न tumoral घटक है, और विभिन्न ट्यूमर microenvironments बुद्धि (ई) अवलोकनएक ही माउस हिन माउस परिवर्तनशीलता 7-9 करने के लिए माउस से बचने के लिए. इस तकनीक के साथ, अलग सेल व्यवहार tumorigenesis के प्रगतिशील चरणों को प्रदर्शित करता है कि स्तन ट्यूमर वायरस (MMTV) प्रमोटर संचालित polyoma बीच टी ओंकोजीन (PyMT) मॉडल में सूचित किया गया है. (Foxp3 EGFP transgene द्वारा कल्पना Tregs,) रक्त वाहिकाओं के लिए निकटता में preferentially विस्थापित विनियामक टी लिम्फोसाइट DCS (CD11c-DTR-EGFP), कार्सिनोमा जुड़े fibroblasts (Fsp1 + / + -EGFP) और माइलॉयड कोशिकाओं (सी एफएमएस जबकि -EGFP) ट्यूमर जन के भीतर से ट्यूमर परिधि में उच्च गतिशीलता दिखा रहे हैं. तीव्र प्रणालीगत हाइपोक्सिया की हालत में, कोशिकाओं को अलग ढंग से चले गए: Tregs 6 स्थानांतरित करने के लिए जारी है कि माइलॉयड कोशिकाओं के विपरीत पलायन को रोकने के. इसके अलावा, एक ही माउस मॉडल में, यह ट्यूमर मंच के साथ कि डॉक्सोरूबिसिन संवेदनशीलता परिवर्तन दिखाया गया है, दवा वितरण दवा प्रतिक्रिया, और डॉक्सोरूबिसिन से संबंधित हैउपचार ट्यूमर के लिए माइलॉयड कोशिकाओं की CCR2 निर्भर भर्ती के लिए जाता है. इस प्रकार, लाइव इमेजिंग भी बगल में दवा प्रतिक्रियाओं में अंतर्दृष्टि और chemoresistance 10,11 के जीव विज्ञान को हासिल किया जा सकता है.

एडिनोमेटस पोली पोसिस कोलाई (APC) जीन उत्परिवर्तन आमतौर पर मानव कोलोरेक्टल adenomas और कार्सिनोमा 12 और पेट के कैंसर 13 के लिए एक अत्यंत उच्च जोखिम होंगी, जिसका पारिवारिक एडिनोमेटस पोली पोसिस (FAP), में APC जीन परिणाम की एक प्रति का उत्परिवर्तन में होते हैं. माउस तनाव Apc न्यूनतम / + APC जीन की कोडोन 850 पर एक ट्रंकेशन उत्परिवर्तन किया जाता है और अनायास सभी छोटी आंत 14 16 पर कई आंतों adenomas विकसित करता है. Peritoneal गुहा खोलने आंत तक पहुंच के लिए आवश्यक है के बाद से आंत का लंबे समय तक intravital इमेजिंग, क्योंकि प्रक्रिया के invasiveness की चुनौती दे रहा है. लघु अवधि के लाइव इमेजिंग सेंटudies पहले से स्वस्थ आंत 17,18 पर प्रकाशित किया गया है, लेकिन ट्यूमर आंतों की लंबी अवधि के प्रत्यक्ष अवलोकन सूचना नहीं गया है. एक शल्य प्रक्रिया पहले से छवि स्तन ट्यूमर 6,10 करने के लिए इस्तेमाल किया intravital कताई डिस्क माइक्रोस्कोपी प्रणाली का उपयोग करते हुए, डिजाइन और आंत की serosal सतह के माध्यम से ट्यूमर कल्पना करने के लिए परिष्कृत किया गया है. इस पत्र में, एक प्रोटोकॉल एक Apc न्यूनतम / + चूहों का उपयोग करके छोटी आंत में ट्यूमर के भीतर माइलॉयड कोशिकाओं के व्यवहार का पालन करने की अनुमति देता है कि वर्णित है.

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Protocol

नोट: सभी पशु प्रयोगों संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC), UCSF द्वारा अनुमोदित प्रक्रियाओं के अनुसार आयोजित की गई. सभी इमेजिंग प्रयोगों गैर अस्तित्व प्रक्रियाओं थे और जानवरों छवि अधिग्रहण के अंत के बाद तुरंत euthanized थे.

चूहे की 1 जनरेशन

नोट: APC जीन पर एक उत्परिवर्तन ले Apc न्यूनतम / + चूहों,, अनायास छोटी आंत में 50-100 adenomas का विकास.

  1. क्रॉस Apc मिन माइलॉयड कोशिकाओं का पता लगाने के लिए C-एफएमएस प्रमोटर के तहत EGFP व्यक्त जो सी एफएमएस-EGFP लाइन के साथ ACTB-ECFP actin के प्रमोटर के तहत ECFP व्यक्त जो लाइन,, और आगे, साथ / + चूहों. ACTB-ECFP और सी एफएमएस-EGFP के लिए विषमयुग्मजी जानवरों प्रतिदीप्ति पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है.
  2. छवि स्पष्ट रूप से पहचाने जाने adenomas के लिए उम्र के 3-4 महीने में चूहों का प्रयोग करें.

एम के 2 तैयारीसर्जरी से पहले aterials

नोट: खुर्दबीन सेट अप के विवरण के पहले किया गया 6,7 वर्णन किया है.

  1. माइक्रोस्कोप
    1. हीटिंग कंबल पर मुड़ें. 488 एनएम उत्तेजना और ठोस राज्य 405 एनएम, 561 एनएम, और 640 एनएम लेज़रों के लिए आर्गन लेजर पर मुड़ें. खुर्दबीन पर मुड़ें, कताई डिस्क नियंत्रण इकाई, AOTF, लेजर नियंत्रण इकाई, और कैमरे के नियंत्रक.
    2. एलईडी लाल हो जाता है, जो माइक्रोस्कोप शटर, खोलें. कंप्यूटर और कैमरे सॉफ्टवेयर ऑन करें.
  2. इमेजिंग मंच
    1. मंच डालने साफ है कि सुनिश्चित करें. अन्यथा, साबुन और पानी और फिर सूखे के साथ साफ.
    2. दो coverslips लो और डालने पर उन्हें सुरक्षित करने के लिए प्रयोगशाला टेप का उपयोग करें. मंच पर डालने प्लेस और शराब पोंछे के साथ साफ.
    3. प्रयोगशाला टेप का प्रयोग, मंच के दाहिनी ओर हीटिंग कंबल देते हैं.
    4. नाक शंकु पर रबर डायाफ्राम की अखंडता को सत्यापित और necessar अगर इसे बदलवाई. स्थिति और धुंध और प्रयोगशाला टेप का उपयोग कर पशु को isoflurane संज्ञाहरण वितरण के लिए नाक शंकु को ठीक.
  3. Isoflurane संज्ञाहरण प्रणाली
    1. Isoflurane टैंक फिर से भरना.
    2. वैक्यूम चालू करें और / मिनट 1.2 एल को समायोजित.
    3. छिटकानेवाला आसुत जल जोड़ें और isoflurane प्रणाली को छिटकानेवाला कनेक्ट.
    4. ऑक्सीजन विश्लेषक चालू करें और isoflurane प्रणाली से कनेक्ट. ऑक्सीजन टैंक को चालू करें और ऑक्सीजन विश्लेषक 100% से पता चलता है कि यह सुनिश्चित करें. / मिनट 0.2 एल ओ 2 प्रवाह को समायोजित करें.
    5. नाइट्रोजन टैंक को चालू करें और / मिनट 0.8 एल में प्रवाह को समायोजित. ऑक्सीजन विश्लेषक 21% से पता चलता है कि यह सुनिश्चित करें.
  4. शल्य चिकित्सा उपकरण और प्लेटफार्म की तैयारी
    1. साबुन और पानी से विच्छेदन संदंश और कैंची की साफ 2 जोड़े.
    2. गर्म मनका अजीवाणु चालू करें और यह 250 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने दें. 30 सेकंड के लिए शल्य चिकित्सा उपकरणों जीवाणुरहित. उन्हें शांत करते हैं.
    3. सर्जरी बेंच पर एक प्रयोगशाला शराबी रखें.
    4. एक शल्य चिकित्सा मंच के रूप में एक स्टायरोफोम ढक्कन का प्रयोग करें. प्रयोगशाला मूसलधार बारिश के एक टुकड़े के साथ कवर. माउस शेविंग के बाद बदलने के लिए प्रयोगशाला मूसलधार बारिश का एक दूसरा टुकड़ा तैयार करें.
    5. कवर स्टायरोफोम ढक्कन पर संज्ञाहरण की लाइन के साथ नाक शंकु, जगह और कुछ टेप के साथ (नहीं प्रयोगशाला शराबी पर) स्टायरोफोम ढक्कन को देते हैं और यह जगह में रखने के लिए नाक शंकु के दोनों किनारों पर दो सुइयों का उपयोग करें.
    6. Betadine, शराब पोंछे, बाँझ धुंध, सुपर गोंद, माइक्रोस्कोप स्लाइड, इलेक्ट्रिक शेवर, और प्रयोगशाला टेप के 4 टुकड़े इकट्ठे.

इंजेक्शन के 3 तैयारी

  1. हुड के तहत, एक इंसुलिन सिरिंज तैयार (28 जी एक्स साढ़े में) 2,000 केडीए rhodamine-dextran (4 मिलीग्राम / एमएल के 100 μl में शेयर AF647 संयुग्मित Ly-6G (Gr1) एंटीबॉडी (1 मिलीग्राम / एमएल) के 7 μl के साथ ) रेट्रो कक्षीय इंजेक्शन के लिए. इन जानवरों में विकसित कि एनीमिया पूंछ नसों difficu बनाता है के बाद से रेट्रो कक्षीय इंजेक्शन Apc न्यूनतम / + चूहों में सिफारिश की हैलेफ्टिनेंट त्वचा के माध्यम से पता लगाने के लिए.
  2. आंत के क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला आंदोलनों तर इमेजिंग से पहले 1 मिलीग्राम / किग्रा चमड़े के नीचे (अनुसूचित जाति) के लिए 150 μl पीबीएस में पतला atropine इंजेक्शन के साथ एक दूसरे इंसुलिन सिरिंज तैयार करें.

इमेजिंग के लिए आंत के 4 तैयारी

  1. प्रेरण कक्ष को संज्ञाहरण लाइन खुला है, और शल्य मेज और माइक्रोस्कोप के लिए लाइनों बंद हो जाती हैं कि सत्यापित करें.
  2. संज्ञाहरण चैम्बर के लिए पशु स्थानांतरण. संज्ञाहरण चैम्बर बंद और (21% 2 हे) के साथ 4% isoflurane पर बारी.
  3. माउस गहरा और धीरे धीरे (5-6 मिनट के बाद) साँस लेता है, इसकी दिशा पर शल्य चरण को हस्तांतरण और Gr1 एंटीबॉडी समाधान और / या dextran समाधान रेट्रो orbitally इंजेक्षन.
  4. शल्य चिकित्सा मंच से जुड़ा हुआ संज्ञाहरण लाइन खोलें. संज्ञाहरण चैम्बर के लिए लाइन को बंद करें और संज्ञाहरण कोन में अपनी नाक के साथ अपनी पीठ पर माउस डाल दिया.
  5. Isoflurane कम करें4% से 2.5% तक की एकाग्रता.
  6. माउस अच्छी तरह से अपनी लुटेरा बन्द रखो और कॉर्निया पलटा परीक्षण द्वारा anesthetized है कि जाँच करें.
  7. संज्ञाहरण के तहत जबकि सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर नेत्र चिकनाई मरहम जोड़ें.
  8. प्रयोगशाला टेप जोड़कर शल्य चरण के लिए माउस के अंगों को सुरक्षित करो.
  9. एक इलेक्ट्रिक शेवर का उपयोग करके उदर सतह से बालों को हटाने. इसके अलावा अधिग्रहण से पहले oximeter स्थिति के लिए छोड़ दिया हिंद अंग से बालों को हटा दें. शल्य चिकित्सा मंच से प्रयोगशाला शराबी निकालें और बाल संक्रमण से बचने के लिए एक साफ एक साथ बदलें.
  10. शराब पोंछे और betadine साथ उदर सतह कीटाणुरहित.
  11. माउस की एक दिशा में अनुसूचित जाति (3.2) से atropine समाधान इंजेक्षन.
  12. त्वचा के माध्यम से एक 1 सेमी उदर midline चीरा और का उपयोग कैंची द्वारा पेरिटोनियम और संदंश की एक जोड़ी बनाते हैं. ध्यान से आंत के 3-4 सेमी बाहर खींचने के लिए और छवि के लिए एक या कई ट्यूमर की पहचान.
  13. एक गिलास माइकर लोoscope स्लाइड और स्थिति शीर्ष पर एक ट्यूमर के साथ उस पर आंत के एक पाश.
  14. स्लाइड को संलग्न करने के आंत के साथ कुछ स्थानों पर कुछ सुपर गोंद जोड़ें. गोंद शुष्क करने के लिए एक मिनट रुको. Confocal साथ अपने स्थानीयकरण की सुविधा के क्रम में ट्यूमर की ओर इशारा करते स्लाइड पर एक लाइन आकर्षित करने के लिए एक मार्कर का उपयोग करें.

5 पोजीशनिंग मंच पर माउस और तैयारी छवि अधिग्रहण के लिए

  1. अंग से प्रयोगशाला टेप निकालें.
  2. खुर्दबीन मंच को संज्ञाहरण लाइन खोलने और शल्य चिकित्सा मंच के लिए एक बंद.
  3. नीचे अपने उदर पक्ष और नाक शंकु में अपनी नाक के साथ खुर्दबीन मंच को ध्यान से माउस स्थानांतरण. कुछ प्रयोगशाला टेप के साथ संज्ञाहरण लाइन सुरक्षित.
  4. फिर से स्थिति कवर फिसल खिड़कियों में से एक के केंद्र में आंत के क्रम में माउस और / या स्लाइड. धीरे प्रयोगशाला टेप के साथ स्लाइड नीचे टेप.
  5. माउस के बाएं अंग करने के लिए oximeter जांच अटैचअपने दिल और श्वसन दर और धमनी ऑक्सीजन संतृप्ति स्तर का पालन करें.
  6. हाइपोथर्मिया से बचने के लिए हीटिंग कंबल के साथ माउस को कवर किया.
  7. इमेजिंग के लिए 1-1.5% के लिए 2.5% से isoflurane एकाग्रता में कमी.

ΜManager सॉफ्टवेयर का उपयोग करके छवियाँ के 6 अधिग्रहण

  1. विन्यास सेटिंग्स में छवि गुणवत्ता में सुधार करने के लिए 2,500 rpm के लिए CSUX गति बढ़ाएँ.
  2. 10X 0.5 एनए या 20X 0.75 एनए Fluar लेंस उद्देश्य का चयन करने के उद्देश्य लटकती मेनू का प्रयोग करें.
  3. रंग लटकती मेनू से लेजर 405 एनएम चुनें.
  4. Live पर क्लिक करें और माइक्रोस्कोप के साथ ध्यान केंद्रित करने को समायोजित.
  5. स्वचालित रूप से छवि में चरम पिक्सेल मूल्यों पर आधारित प्रदर्शन छवि का अधिकतम और न्यूनतम पिक्सेल तीव्रता को समायोजित करने के लिए ऑटो पर क्लिक करें. प्रदर्शन छवि के पिक्सेल तीव्रता का एक हिस्टोग्राम मुख्य विंडो के निचले हिस्से में ग्राफ में प्रस्तुत किया है.
  6. द्वारा मुरलीवाला नियंत्रण कक्ष की खिड़की में कैमरे जोखिम को समायोजितघड़ियों की संख्या (एक घड़ी 33.333 मिसे है) बदल रहा है.
  7. संकेत सबसे कम जोखिम के साथ बहुत उज्ज्वल है, तो माइक्रोस्कोप नियंत्रण इकाई का उपयोग लेजर तीव्रता में कमी.
  8. 488 एनएम, 561 एनएम और 640 एनएम लेजर लाइनों के लिए संकेत तीव्रता की जाँच करें. लेजर के स्वयं के नियंत्रण इकाई (488 एनएम और 561 एनएम) या खुर्दबीन नियंत्रण इकाई के साथ लेजर तीव्रता को समायोजित.
  9. मल्टी डी अधिग्रहण विंडो में, समय अंक बॉक्स की जांच और समय बिंदुओं की संख्या और वांछित समय अंतराल में टाइप करें.
  10. , जेड ढेर बॉक्स को चेक करें "रिश्तेदार जेड" चुनते हैं और वर्तमान स्थिति को जेड शुरू और जेड अंत रिश्तेदार को परिभाषित.
    नोट: 10x या 20x उद्देश्य के लिए, के अलावा क्रमश: 3 जेड विमानों, 8 माइक्रोन या 4 माइक्रोन के साथ शुरू करते हैं.
  11. कई स्थानों इमेजिंग के लिए कई पदों (XY) बॉक्स को चेक करें, तो संपादित स्थिति सूची क्लिक 4 से 6 विभिन्न पदों के निशान.
  12. चैनल बॉक्स को चेक करें और नई से चैनल जोड़ने और लेज़रों लटकती मेनू और typ से लाइनों का चयन(33.333 मिसे के गुणकों में) प्रत्येक चैनल के लिए जोखिम में ई.
  13. "मल्टी डी अधिग्रहण" खिड़की में सहेजें छवियों की जाँच करें.
  14. एक फ़ोल्डर का चयन करें और अधिग्रहीत सभी छवियों को स्वचालित रूप से दिया गया नाम उपसर्ग के साथ इस फ़ोल्डर में सहेजा जाएगा.
    नोट: प्रत्येक निरंतर अधिग्रहण हर समय बिंदु पर हर रंग में हर जेड टुकड़ा के लिए व्यक्तिगत झगड़ा फ़ाइलों के रूप में एक अलग सबफ़ोल्डर में सहेजा जाएगा.
  15. मल्टी डी अधिग्रहण खिड़की में सेटिंग सहेजें क्लिक करके सभी सेटिंग्स सहेजें.
  16. अधिग्रहण शुरू करने के लिए बहु आयामी अधिग्रहण विंडो में मोल क्लिक करें.
  17. Oximeter जांच नहीं किया जाता है या अच्छी तरह से काम बंद हो जाता है तो (नाड़ी स्थिर या पता लगाने के लिए मुश्किल नहीं है जब), लुटेरा बन्द रखो और कॉर्निया पलटा जाँच करके संज्ञाहरण की दक्षता इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान हर 15 मिनट की जाँच करें. माउस इन उत्तेजनाओं के लिए उत्तरदायी है अगर संज्ञाहरण समायोजित करें.
  18. अधिग्रहण के बाद, isoflurane एकाग्रता बढ़ाने के द्वारा माउस euthanize5% करने के लिए राशन. कोई साँस लेने आंदोलनों detectable हैं, जब मंच से माउस को हटाने और एक गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था प्रदर्शन करते हैं.

Imaris सॉफ्टवेयर का उपयोग करके छवियाँ की 7 विश्लेषण

  1. रूपांतरण फ़ाइलें (अनुपूरक चित्रा 1 ए) .ims को
    1. , कैमरा सॉफ्टवेयर खुला फाइल फिर बैच कनवर्टर पर क्लिक करें.
    2. पर क्लिक करें फ़ाइलें जोड़ें और पहले की स्थिति के पहले फ़ाइल का चयन करें. प्रत्येक स्थिति के लिए दोहराएँ.
    3. अपलोड किए गए प्रत्येक फ़ाइल के लिए, सेटिंग्स पर क्लिक करें और जेड के ढेर के लिए समय चैनल के लिए, "सी" और "Z" के लिए सेटिंग्स "टी" उस क्रम में दिखाई देते हैं सत्यापित.
    4. इच्छित फ़ोल्डर में सहेजें. ब्राउज़ करें और परिवर्तित रूप में एक नई फ़ाइल बनाएँ.
    5. सभी के लिए सेट पर क्लिक करें और शुरू करो.
  2. समायोजन (पूरक चित्रा 1 बी)
    1. विशिष्ट परिवर्तित फ़ोल्डर में जाओ और पहले फ़ाइल को खोलने के.
    2. प्रदर्शन समायोजन विंडो में पृष्ठभूमि को समायोजितयदि आवश्यक हो तो हर चैनल के लिए न्यूनतम संख्या को संशोधित करके संकेत कटऑफ.
    3. यदि आवश्यक हो, अधिकतम संख्या (कम अधिकतम संख्या, उच्च संकेत की तीव्रता) को संशोधित करने से संकेत तीव्रता को समायोजित.
      नोट: संकेत तीव्रता / विपरीत की समायोजन एक अच्छे दृश्य के क्रम में एक सेल व्यवहार या एक डिब्बे से उजागर कर सकें. यह परिणाम ही बदल नहीं है.
    4. संपादित करें और छवि गुण पर क्लिक करें.
    5. एक्स, वाई, जेड और मूल्यों को बदलने (एक 10x उद्देश्य, एक्स और वाई = 0.712, जेड = 8 माइक्रोन के लिए, एक 20x उद्देश्य के लिए: एक्स और वाई = 0.36, जेड = 4 माइक्रोन).
    6. समय बिंदुओं को समायोजित करने के लिए सभी समान दूरी पर क्लिक करें. प्रारंभ तारीख जोड़ें और अधिग्रहण के समय शुरू करते हैं. अंत तारीख जोड़ें और अधिग्रहण (अनुपूरक चित्रा 1C) का समय खत्म होता है.
    7. फिल्म देखने के लिए प्ले बटन पर क्लिक करें.
    8. क्लिक करें, संपादन और धुंधली छवियों को नष्ट करने के लिए समय अंक हटाएं.
    9. दो अलग अधिग्रहण toge शामिल होने के लिएवहाँ एक फिल्म में, पहली फिल्म का पिछली बार बात करने के लिए जाने के लिए और संपादित करें पर क्लिक करें> दूसरी फाइल जोड़ने के लिए समय अंक जोड़ें.
  3. एक फिल्म के रूप में सहेजा जा रहा है (अनुपूरक चित्रा -1)
    1. रिकॉर्ड पर क्लिक .Mov विस्तार और 0 का एक संपीड़न कारक का चयन करें.
    2. सहेजें पर क्लिक करें.

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Representative Results

ACTB-ECFP; Apc न्यूनतम / + की छोटी आंत में कताई डिस्क confocal माइक्रोस्कोपी, गैर tumoral और tumoral ऊतकों का उपयोग करके सी एफएमएस-ECFP चूहों serosal सतह से देखे जा सकते हैं. इमेजिंग के बाद, कैमरा सॉफ्टवेयर का विश्लेषण और अधिग्रहण (अनुपूरक चित्रा 1) को समायोजित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. फ्लोरोसेंट 2,000 केडीए dextran-rhodamine की नसों (चतुर्थ) इंजेक्शन और एक Ly-6G 647 संयुग्मित एंटीबॉडी, के बाद रक्त वाहिकाओं और PMNs क्रमशः (चित्रा 1) का पता लगाया जा सकता है. Lymphoid ऊतक एकत्रित कर रहे हैं और माइलॉयड कोशिकाओं से भरा आसानी से देखा जा सकता है कि Peyer के धब्बे (चित्रा 1 ए). छोटी आंत के तहखाने रक्त वाहिकाओं और माइलॉयड कोशिकाओं (चित्रा 1 ए और 1 बी) से घिरे हैं. Tumoral ऊतक अक्सर अधिक vascularized और अधिक माइलॉयड कोशिकाओं द्वारा घुसपैठ की है, और तहखाने की संरचना डब्ल्यू कम हैपक्ष ट्यूमर के आकार पर निर्भर करता है (चित्रा 1 ए और 1 बी) का आयोजन किया. 676 (अधिग्रहण एक 10X 0.5 एनए (चित्रा 1 ए) और 20X 0.75 एनए Fluar लेंस (चित्रा 1 बी) का उपयोग करके किया जा सकता है, लेकिन हम एक बड़े क्षेत्र के अधिग्रहण की अनुमति उज्ज्वल था जो 10X 0.5 एनए Fluar लेंस के साथ सबसे अच्छा प्रदर्शन प्राप्त X 676 माइक्रोन) और ऊतकों में 70 माइक्रोन से छवियों को प्रदान कर सके. चिकनी पेशी परत व्यक्त actin-ECFP कभी कभी आंतों उपकला मुश्किल (चित्रा 1 बी, सही पैनल) पर ध्यान केंद्रित प्रदान कर सकते हैं. एनिमेटेड / वीडियो चित्रा 2 में दिखाया गया है ट्यूमर में माइलॉयड कोशिकाओं की गतिशीलता कुछ घंटों के लिए वास्तविक समय में पीछा किया जा सकता. Neutrophils (Gr1 + कोशिकाओं) तहखाने के चारों ओर, रक्त वाहिकाओं में प्रसारित और ऊतकों, अन्य माइलॉयड कोशिकाओं, ज्यादातर मैक्रोफेज गश्त जबकि और (एनिमेटेड / वीडियो चित्रा 2) कम गतिशील हैं.


Apc न्यूनतम / + चूहों से गैर tumoral और tumoral ऊतक की कताई डिस्क confocal साथ प्राप्त 1. प्रतिनिधि चित्र चित्रा. (ए) APC न्यूनतम / + की serosal सतह से छोटी आंत उपकला के चार रंग चित्र (10X Fluar, 0.5 एनए लेंस); ACTB-ECFP, चतुर्थ फ्लोरोसेंट 2,000 केडीए dextran-rhodamine प्राप्त कि सीएफएमएस-EGFP माउस (लाल) और एक Ly-6G 647 संयुग्मित एंटीबॉडी (सफेद). बाएं पैनल गैर tumoral उपकला से पता चलता है और सही पैनल में एक ही Apc न्यूनतम / + से एक ट्यूमर से पता चलता है; ACTB-ECFP; सीएफएमएस-EGFP माउस. माइलॉयड कोशिकाओं हरा कर रहे हैं और उपकला कोशिकाओं नीले हैं. C-एफएमएस + कोशिकाओं का एक समूह एक Peyer के पैच (सफेद तीर), पैमाने बार = 100 माइक्रोन. (बी) के चार रंग चित्र (20X Fluar, 0.5 एनए में गैर tumoral आंतों ऊतक में देखा जाता हैACTB-ECFP; एक Apc न्यूनतम / + की serosal सतह से छोटी आंत उपकला के लेंस) सीएफएमएस-EGFP ट्यूमर. बाएं पैनल में, कई डबल सकारात्मक Gr1 + C-एफएमएस + कोशिकाओं tumoral ऊतक में पता चला रहे हैं. सही पैनल मुश्किल आंतों उपकला, पैमाने बार = 50 माइक्रोन पर ध्यान केंद्रित प्रदान कर सकते हैं कि actin-ECFP व्यक्त चिकनी पेशी परत की एक तस्वीर दिखाता है.

एनिमेटेड / वीडियो चित्रा 2 . एक APC न्यूनतम / + माउस से एक 3 मिमी ग्रंथ्यर्बुद में माइलॉयड सेल गतिशीलता. के serosal सतह से छोटी आंत उपकला (10X Fluar, 0.5 एनए लेंस) के चार रंग समय चूक एक Apc न्यूनतम / + ; ACTB-ECFP; सीएफएमएस-EGFP माउस सह इंजेक्शन 2,000 फ्लोरोसेंट केडीए dextran-rhodamine (लाल) और एक Ly-6G 647 संयुग्मित एंटीबॉडी (सफेद) के साथ. माइलॉयड कोशिकाओं हरा कर रहे हैं औरउपकला कोशिकाओं नीले हैं. तहखाने के आसपास माइलॉयड कोशिकाओं नहीं बढ़ रहे हैं. कुछ neutrophils (सफेद में Gr1 + कोशिकाओं) ऊतकों में गश्त कर रहे हैं. यह एक 2 घंटा अधिग्रहण है और फिल्म 295 बार ऊपर निकल गया है.

पूरक चित्रा 1 . अधिग्रहण विश्लेषण के लिए कैमरा सॉफ्टवेयर के स्क्रीन शॉट्स. (ए) पहले, फाइलें .ims एक्सटेंशन में परिवर्तित करने की आवश्यकता. (बी) तब, प्रदर्शन छवियों ऐसे विशिष्ट संकेत के रूप में समायोजित किया जा सकता है बढ़ाया जा सकता है और पृष्ठभूमि में कमी आई . (सी) तिथि और समय की जरूरत है. एक वास्तविक समय फिल्म पाने के लिए समायोजित किया जाना है (डी) के अधिग्रहण एक फिल्म के रूप में बचाया जा सकता है.

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Discussion

इस पत्र में, एक विस्तृत प्रोटोकॉल पेट की serosal ओर से imaged एक जीवित जानवर में कई घंटे के लिए ट्यूमर आंतों में माइलॉयड सेल गतिशीलता की डिस्क confocal इमेजिंग कताई के लिए वर्णित है.

सूजन से बचने के लिए और इष्टतम शारीरिक स्थिति है, आंत की इमेजिंग बरकरार अंग पर किया जाना है. प्रकाश उपकला तक पहुँचने से पहले इस तरह की चिकनी मांसपेशियों के रूप में अलग ऊतक परतों के माध्यम से जाना पड़ता है हालांकि, बाद से आंत का serosal ओर से इमेजिंग, चुनौती दे रहा है. Actin अत्यधिक चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं द्वारा व्यक्त की है तब से उपकला पर ध्यान केंद्रित विशेष रूप से actin-ECFP संवाददाता चूहों में, कुछ क्षेत्रों में मुश्किल हो सकता है. दो photon माइक्रोस्कोपी confocal सूक्ष्मदर्शी की तुलना में गहरी ऊतक प्रवेश का लाभ दिया है, हम कताई डिस्क confocal खुर्दबीन आंतों उपकला संरचना का एक अच्छा दृश्य प्राप्त करने के लिए पर्याप्त शक्तिशाली है कि पाया. फायदे ओच कताई डिस्क माइक्रोस्कोपी confocal संकल्प त्याग के बिना बहुत तेजी से अधिग्रहण और अद्वितीय संवेदनशीलता के लिए क्षमता शामिल हैं. इन गुणों को कुछ समय बिंदुओं के कारण आंदोलन कलाकृतियों को नष्ट कर दिया जाना है, भले ही गतिशील प्रक्रियाओं का अवलोकन, photodamage को कम, और अपेक्षाकृत कमजोर फ्लोरोसेंट अणुओं की इमेजिंग सक्षम अनुमति देते हैं.

Serosal ओर से इमेजिंग आंत भी क्योंकि इस अंग की अंतर्जात क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला आंदोलनों का चुनौतीपूर्ण हो सकता है. इस प्रोटोकॉल में, atropine के एक अनुसूचित जाति इंजेक्शन इमेजिंग से पहले दिए गए, और यह कुशलतापूर्वक आंदोलन कम हो जाती है. हालांकि, यह क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला आंदोलन बड़ी आंत में अधिक व्यापक है, लेकिन अच्छी तरह से पेट के इस हिस्से में काफी मुश्किल इमेजिंग प्रतिपादन, atropine उपचार से हिचकते नहीं है कि नोट करना महत्वपूर्ण है. पेट में चिकनी पेशी परत छोटी आंत को ompared और अधिक सिकुड़ा प्रतीत होता सी कुछ अधिक प्रमुख है. इसलिए, यहactin-ECFP संवाददाता चूहों में उपकला पर ध्यान केंद्रित करने के लिए लगभग असंभव है. इसके अलावा, इन अंतर्जात आंदोलनों के अलावा, अंग बहती हो सकता है, लेकिन इस मामले पीछे बहाव सुधार में कैमरा सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया जा सकता है.

इनवेसिव इमेजिंग प्रयोगों में एक और बड़ी चुनौती संज्ञाहरण के तहत जीवित और स्वस्थ रूप में लंबे समय के रूप में संभव माउस रखने के लिए है. आंत peritoneal गुहा खोलने से पहुँच जाता है. इस प्रकार की प्रक्रिया की वजह से पेरिटोनियम की अखंडता के लिए 40 घंटे के लिए किया जा सकता है जो स्तन ट्यूमर इमेजिंग, के लिए प्रयोग किया जाता है कि अधिक से अधिक आक्रामक है. खोला peritoneal गुहा के साथ किया अधिकतम अधिग्रहण 6 घंटा थी, लेकिन माउस तो अब भी अधिग्रहण संभव हो सकता है, अभी भी संकट का कोई स्पष्ट संकेत के साथ जीवित था.

इस अध्ययन माइलॉयड में सेल व्यवहार का पालन किया जा सकता है और फ्लोरोसेंट संवाददाता चूहों और भी fluorochrome संयुग्मित टी का उपयोग करके आंतों ट्यूमर के भीतर विश्लेषणracers या एंटीबॉडी. यह दृष्टिकोण भी ऐसे Tregs के रूप में अन्य प्रकार की कोशिकाओं, यह स्तन ट्यूमर अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है, के रूप में क्रमश: Foxp3-EGFP या CD11c-DTR-EGFP, या Fsp1-EGFP संवाददाता चूहों का उपयोग करके वृक्ष के समान कोशिकाओं या fibroblasts के अवलोकन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है 6 . इसके अलावा, neutrophils के अलावा अन्य सेल आबादी के खिलाफ फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी इसके अलावा चतुर्थ इंजेक्शन जा सकता है, सेल व्यवहार भी ऐसी हाइपोक्सिया के रूप में अलग अलग परिस्थितियों में विश्लेषण किया जा सकता है. इस तरह के प्रयोगों कीमोथेरेपी या लक्षित चिकित्सा के साथ इलाज के बाद उन स्ट्रोमा कोशिकाओं के व्यवहार में नए अंतर्दृष्टि दे सकते हैं. अंत में, इस प्रोटोकॉल आंत्र कैंसर के अन्य माउस मॉडल में और ट्यूमर प्रगति के विभिन्न चरणों में किया जा सकता है. Apc न्यूनतम / + चूहों चूहों एक छोटा देता है क्योंकि दुष्टता पर प्रगति नहीं है जो केवल आंतों एडिनोमेटस जंतु, विकास. यह अधिक के सकल साथ अन्य आंत्र कैंसर मॉडल में माइलॉयड कोशिकाओं की गतिशील अध्ययन करने के लिए दिलचस्प हो जाएगाइस तरह कश्मीर रास में Apc उत्परिवर्तन के अलावा 19-21 या Smad4 22 जीन म्यूटेशन ले जाने चूहों के रूप में ressive और आक्रामक ट्यूमर.

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Acknowledgments

हम Apc न्यूनतम / + चूहों जीनोटाइपिंग के लिए यिंग यू धन्यवाद देना चाहूंगा. इस अध्ययन INSERM से धन और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान से अनुदान (CA057621 और AI053194) द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ApcMin/+ mice Jackson Laboratory 2020
ACTB-ECFP mice Jackson Laboratory 3773
cfms-EGFP mice Jackson Laboratory 18549
2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated Invitrogen D7139
Isoflurane Butler Animal Health Supply 29450
Nitrogen UCSF
Oxygen UCSF
1x PBS UCSF cell culture facility
Saline Buffer UCSF cell culture facility
Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647 UCSF Monoclonal antibody core Stock 1 mg/ml. Use at 7 μg/mouse
Atropine LARC UCSF Use at 1 mg/kg mouse
Alcohol wipes Becton Dickinson 326895
28 G x 1/2 in. insulin syringe Becton Dickinson 329465
Remium cover glass Fisher Scientific 12-548-5M 24x50-1
Betadine LARC UCSF
Heat blanket Gaymar Industries
Hot bead sterilizer Fine Science Tools 18000-45 Turn ON 30 min before use
Cotton tipped apllicators 6-inch Electron Microscopy Sciences 72310-10
Anesthesia system Summit Anesthesia Support
Inverted microscope Carl Zeiss Inc Zeiss Axiovert 200M
Stage insert Applied Sientific Instrumentation
Mouse Ox oximeter, software and sensors Starr Life Sciences MouseOx
Nebulizer Summit Anesthesia Support
Imaris Bitplane
μManager Vale lab, UCSF Open-source software
ICCD camera Stanford Photonics XR-Mega-10EX S-30
Spinning disk confocal sacan-head Yokogawa Corporation CSU-10b

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References

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कैंसर जीवविज्ञान अंक 92 intravital इमेजिंग डिस्क confocal कताई, कोलोरेक्टल कैंसर ट्यूमर माइलॉयड कोशिकाओं
में माइलॉयड कोशिकाओं गतिशीलता की वास्तविक समय इमेजिंग<em&gt; Apc<sup&gt; न्यूनतम / +</sup</em&gt; ट्यूमर आंतों डिस्क confocal माइक्रोस्कोपी कताई द्वारा
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Bonnans, C., Lohela, M., Werb, Z.… More

Bonnans, C., Lohela, M., Werb, Z. Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (92), e51916, doi:10.3791/51916 (2014).

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