Abstract
Myeloide celler er de mest rigelige immunceller i tumorer og har vist sig at fremme tumorudvikling. Moderne intravital billeddiagnostiske teknikker muliggøre observation af levende cellulær adfærd inde i orglet, men kan være en udfordring i nogle typer af kræft som følge af orgel og tumor tilgængelighed såsom tarmen. Direkte observation af intestinale tumorer er ikke tidligere blevet rapporteret. En kirurgisk procedure, der er beskrevet her tillader direkte observation af myeloide celle dynamik inden for de intestinale tumorer i levende mus ved hjælp af transgene fluorescerende reporter mus og injicerbare sporstoffer eller antistoffer. Til dette formål har en fire-farve, multi-region, mikro-lensed roterende skive konfokalt mikroskop, der giver langsigtet kontinuerlig billeddannelse med køb hurtig billede blevet brugt. APC Min / + mus, der udvikler flere adenomer i tyndtarmen krydses med c-fms-EGFP mus for at visualisere myeloide celler og med ACTB-ECFP musat visualisere intestinale epitelceller i krypterne. Procedurer for mærkning forskellige tumor komponenter, såsom blodkar og neutrofiler, samt proceduren for placering af tumor til billeddannelse gennem serøse overflade er også beskrevet. Time-lapse film indsamlet fra flere timers billeddannelse tillader analyse af myeloid celle adfærd in situ i tarmen mikromiljø.
Introduction
Overvældende beviser viser nu, tumormikromiljøet bestående af heterogene cellepopulationer, herunder fibroblaster, endotelceller, immune og inflammatoriske celler, ekstracellulære matrix, og opløselige faktorer spiller en afgørende rolle i initiering og progression af faste tumorer ved at bidrage til næsten alle kendetegnende for kræft 1. Faktisk under tumorprogression, der konstant dynamiske interaktioner mellem transformerede cancerceller og stromale celler, der udvikler sig til at frembringe et gunstigt malignitet 2 mikromiljø. Blandt de immunceller der infiltrerer tumormikromiljøet, myeloide celler er den mest rigelige 3. Bestående af tumorassocierede makrofager (TAM), myeloide afledt suppressor celler (MDSCs), dendritiske celler (DC) og neutrofiler (PMN'er) er myeloide celler rekrutteret fra knoglemarv og gradvist infiltrere tumorer frigive cytokiner, vækstfaktorer og proteaser, som kan fremmetumorvækst og spredning 4. Krydstale mellem cancerceller og myeloide celler er kompliceret, men dynamisk. Således forståelse af karakteren af deres samspil er afgørende for, hvorfor disse celler fremmer udviklingen af kræft i stedet for at deltage i et immunrespons anti-tumor, og kan hjælpe med at finde nye mål at kontrollere den.
Direkte observation af intravital mikroskopi giver oplysninger om celle dynamik inden for væv af levende mus 5. En fire-farve, multi-region, mikro-lensed roterende skive konfokalt system blev udformet til at studere stromale celler i brysttumorer 6. Denne tilgang gør det muligt langsigtet kontinuerlig billeddannelse og omfatter flere fordele såsom (a) hurtige billeder erhvervelse at minimere bevægelsesartefakter, (b), langvarig anæstesi, (c) fire farver erhvervelse at følge forskellige celletyper, (d) fluorescensmærkning forskellige tumorale komponenter og (e), observation af forskellige tumor mikromiljøer within samme mus for at undgå mus variabiliteten mus 7-9. Med denne teknologi, har forskellige celletyper adfærd blevet rapporteret i den brysttumorvirus (MMTV) promotordrevet polyom midten T onkogen (PyMT) model, der viser progressive stadier af tumorigenese. Regulatoriske T-lymfocytter (tregs, visualiseret ved den Foxp3 EGFP transgen) vandrer fortrinsvis i nærheden af blodkar mens DC'er (CD11c-DTR-EGFP), carcinoma-associerede fibroblaster (Fsp1 + / + -EGFP) og myeloide celler (c-fms -EGFP) udviser højere motilitet ved tumoren periferien end i tumoren masse. I den tilstand af akut systemisk hypoxi, cellerne er migreret anderledes: tregs stoppe migrere i modsætning til myeloide celler, der fortsætter med at bevæge 6. Desuden, i den samme musemodel, er det blevet vist, at doxorubicin følsomhed ændringer med tumor stadium er lægemiddelfordeling relateret til lægemiddel respons, og doxorubicinbehandling fører til CCR2-afhængig rekruttering af myeloide celler til tumorer. Således kan den direkte billedvisning også bruges til at få indblik i narkotika reaktioner in situ og biologi kemoterapiresistens 10,11.
Adenomatøs polypose coli (APC) genmutationer almindeligt forekommende i humane kolorektale adenomer og karcinomer 12 og mutation af en enkelt kopi af APC-genet resulterer i familiær adenomatøs polypose (FAP), som giver en ekstremt høj risiko for tyktarmskræft 13. Den musestamme Apc Min / + bærer en trunkering mutation ved kodon 850 af APC-genet og spontant udvikler multiple intestinale adenomer hele tyndtarmen 14.-16. Langsigtet intravitalt billeddannelse af tarmen er udfordrende på grund af invasiv procedure, idet åbning af bughulen er nødvendig for adgang til tarmen. Kortsigtet direkte billedvisning studies har tidligere været udgivet på sund tarm 17,18, men på lang sigt direkte observation af intestinale tumorer er ikke blevet rapporteret. Et kirurgisk indgreb er designet og raffineres for at visualisere tumorer gennem den serøse overflade af tarmen ved hjælp af intravital roterende skive mikroskopi systemet tidligere er anvendt til billedet brysttumorer 6,10. I dette papir, er en protokol, der er beskrevet, der tillader en at følge adfærden af myeloide celler i tumorer i tyndtarmen ved hjælp af APC Min / + mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de procedurer, der er godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC), UCSF. Alle de billeddannende eksperimenter var ikke-overlevelse procedurer og dyrene blev aflivet umiddelbart efter afslutningen af billedet erhvervelsen.
1. Generering af mus
BEMÆRK: Apc Min / + mus, der bærer en mutation på APC-genet, udvikler spontant 50-100 adenomer i tyndtarmen.
- Cross Apc MIN / + mus med ACTB-ECFP linje, der udtrykker ECFP under actinpromotoren og yderligere med C-FMS-EGFP linje, der udtrykker EGFP under c-fms promotor til at registrere de myeloide celler. Heterozygote dyr til ACTB-ECFP og c-fms-EGFP bruges til at opdage fluorescens.
- Brug mus ved 3-4 måneders alderen til billedet klart påviselige adenomer.
2. Fremstilling af Materialer før operation
BEMÆRK: Detaljerne i mikroskop set-up har været beskrevet tidligere 6,7.
- Mikroskop
- Tænd varme tæppe. Tænd argon laser til 488 nm excitation og solid state 405 nm, 561 nm og 640 nm lasere. Tænd mikroskopet, den roterende skive styreenhed, den AOTF, laser styreenhed, og kameraet controller.
- Åbn mikroskop lukker, som drejer LED rød. Tænd for computeren og kamera-software.
- Imaging Platform
- Sørg for, at scenen indsatsen er ren. Ellers ren med sæbe og vand og derefter tørre.
- Tag to dækglas og bruge lab tape til at sikre dem på indsatsen. Sæt indsatsen på scenen, og rengør den med spritservietter.
- Ved hjælp af lab tape vedhæfte varmetæppe til højre side af scenen.
- Kontrollér integriteten af gummimembran på næsen kegle og ændre det, hvis necessary. Position og fastgør næsekeglen for isofluran anæstesi levering til dyret ved hjælp af gaze og lab tape.
- Isofluran Anæstesi System
- Fyld isofluran tanken.
- Tænd for vakuum og juster til 1,2 l / min.
- Tilføj destilleret vand til forstøveren og tilslut forstøveren til isofluran system.
- Tænd oxygenanalysator og tilslut det til isofluran-systemet. Tænd for ilt tank og sikre, at den oxygenanalysator viser 100%. Juster O 2 flow til 0,2 l / min.
- Tænd nitrogentanken og justere flowet ved 0,8 l / min. Sørg for, at oxygenanalysator viser 21%.
- Udarbejdelse af Kirurgi Værktøj og Platform
- Clean 2 par dissektion pincet og saks med sæbe og vand.
- Tænd varme perle sterilisator og lad det nå 250 ° C. Steriliser kirurgi værktøjer til 30 sek. Lad dem køle af.
- Placer en lab soaker på operationsdagen bænken.
- Brug en Styrofoam låg som en kirurgisk platform. Dæk med et stykke lab soaker. Forbered en anden stykke lab soaker at ændre efter barbering musen.
- Placer næse kegle med den linje af anæstesi på den overdækkede Styrofoam låget, og fastgør den til styrofoam låg (ikke på laboratoriet soaker) med noget tape og bruge to nåle på begge sider af næsen kegle til at holde det på plads.
- Saml betadine, spritservietter, steril gaze, super lim, mikroskop plader, elektrisk barbermaskine, og 4 stykker af lab tape.
3. Fremstilling af injektioner
- Under kølerhjelmen, udarbejde en insulinsprøjte (28 G x ½ cm) med 7 pi lager AF647-konjugeret Ly-6G (Gr1) antistof (1 mg / ml) i 100 ul 2.000 kDa rhodamin-dextran (4 mg / ml ) til retroorbital injektion. Retroorbital injektion anbefales i APC MIN / + mus, da anæmi, der udvikler sig i disse dyr gør halevenerne difficuDet at detektere gennem huden.
- Forbered en anden insulinsprøjte med 1 mg / kg atropin fortyndet i 150 pi PBS til subkutan (sc) injektion før billeddannelse til at dæmpe peristaltiske bevægelser i tarmen.
4. Forberedelse af tarmen for Imaging
- Kontroller, at anæstesi linje til induktion kammer er åben, og at ledningerne til operationsbordet og mikroskop er lukket.
- Overfør dyret for anæstesi kammer. Luk anæstesi kammer og tænd for isofluran til 4% (med 21% O 2).
- Når musen trækker vejret dybt og langsomt (efter 5-6 min), overføre det til den kirurgiske scene på sin flanke og injicere Gr1 antistof løsning og / eller dextranopløsning retro transorbitalt.
- Åbn anæstesi linje er knyttet til det kirurgiske platformen. Luk linje til anæstesi kammer og sætte musen på ryggen med næsen i anæstesi kegle.
- Reducer isoflurankoncentration fra 4% til 2,5%.
- Kontroller, at musen er godt bedøvet ved at klemme dens trædepuden og teste hornhinderefleks.
- Tilføj oftalmologiske smørende salve på øjnene for at forhindre tørhed, mens under anæstesi.
- Fastgør lemmer af musen til det kirurgiske fase ved at tilføje lab tape.
- Fjerne hår fra den ventrale overflade ved hjælp af en elektrisk barbermaskine. Også fjerne hår fra venstre bagben for at placere oximetret før overtagelsen. Tag lab soaker fra den kirurgiske scenen og erstatte med en ren for at undgå hår forurening.
- Desinficer den ventrale overflade med spritservietter og betadine.
- Injicer atropin løsning (fra 3.2) fm i den ene flanke af musen.
- Lav en 1 cm ventralt midtlinie incision gennem huden og peritoneum ved hjælp af en saks og en tang. Træk forsigtigt 3-4 cm af tarmen og identificere en eller flere tumorer til billedet.
- Tag et glas MICRoscope dias og position en løkke af tarmen på det med en tumor på toppen.
- Tilføj nogle superlim til et par steder langs tarmen til at fastgøre den til diaset. Vent et minut til limen tørre. Brug en markør til at trække en streg på diaset peger på tumoren for at lette dens lokalisering med konfokal.
5. Placering af musen på scenen og Forberedelse til Image Acquisition
- Fjern lab tape fra lemmerne.
- Åbn anæstesi linje mikroskopbordet og lukke den ene til den kirurgiske platformen.
- Overfør musen omhyggeligt mikroskopbordet med ventrale nedad og dens næse næsekeglen. Fastgør anæstesi tråd med nogle lab tape.
- Re-placere musen og / eller slide for at få tarmen i centrum af en af de cover-gled vinduer. Tape forsigtigt ned diaset med lab tape.
- Fastgør oximeterprobe til venstre ben af musen tilfølge sit hjerte og respirationsfrekvens og arteriel iltmætning niveauer.
- Dæk musen med varmetæppe at undgå hypotermi.
- Reducer isofluran koncentration fra 2,5% til 1-1,5% til billeddannelse.
6. Køb af billeder ved at bruge μManager Software
- Øg CSUX hastigheden til 2.500 rpm til at forbedre billedkvaliteten i konfigurationsindstillinger.
- Brug Målsætning rullemenuen til at vælge 10X 0,5 NA eller 20X 0,75 NA Fluar linse mål.
- Vælg laseren 405 nm fra Color rullemenuen.
- Klik på Live og justere fokus med mikroskopet.
- Klik på Auto for automatisk at justere maksimum og minimum pixel intensiteter af skærmbilledet baseret på de ekstreme pixelværdier i billedet. Et histogram af display billedets pixel intensiteter er præsenteret i grafen i den nedre del af hovedvinduet.
- Juster kameraets eksponering i vinduet Piper Kontrolpanel vedat ændre antallet af ure (Et ur er 33.333 ms).
- Hvis signalet er for lyst med laveste eksponering, mindske laser intensitet ved hjælp af mikroskop styreenheden.
- Kontroller signalet intensitet for 488 nm, 561 nm og 640 nm laser linjer. Juster laser intensitet med laseren egen styreenhed (488 nm og 561 nm) eller mikroskop styreenhed.
- I Multi D Acquisition vinduet markere feltet Tidspunkter og skriv antallet af tidspunkter og ønskede tidsinterval.
- Afkrydsningsfelt z-stakke, vælg "relativ Z" og definere Z-start og Z-ende i forhold til den aktuelle position.
BEMÆRK: 10X eller 20X objektiv, start med 3 Z fly, 8 um eller 4 um hinanden hhv. - Tjek flere positioner (XY) kasse til billeddannelse flere steder, og klik derefter på Rediger position liste, markere 4 til 6 forskellige positioner.
- Afkrydsningsfelt Kanaler og tilføje kanaler fra New og vælg lasere linjer fra rullemenuen og typei eksponering for hver kanal (i multipla af 33.333 ms).
- Check gemme billeder i "Multi D erhvervelse" vinduet.
- Vælg en mappe og alle de billeder, der er erhvervet, vil automatisk blive gemt i denne mappe med navnet præfiks givet.
BEMÆRK: Hver kontinuerlig Købet vil blive gemt i en separat undermappe som individuelle TIFF-filer for hver Z skive i hver farve på hvert tidspunkt. - Gem alle indstillinger ved at klikke på Gem indstillinger i Multi D Acquisition vinduet.
- Klik på Acquire i Multi-dimensional Acquisition vinduet for at starte købet.
- Hvis oximeterprobe ikke er brugt eller ophører med at arbejde godt (når pulsen er ikke stabil eller svært at opdage), kontrollere effektiviteten af anæstesi hver 15 min under imagografiproceduren ved at knibe trædepuden og kontrollere hornhinderefleks. Juster anæstesi hvis musen er lydhøre over for disse stimuli.
- Efter købet, aflive musen ved at øge isofluran concentration til 5%. Når der ikke er vejrtrækning bevægelser er påviselige fjerne musen fra scenen og udføre en halsdislokation.
7. Analyse af billeder ved at bruge Imaris Software
- Omdannelse til .ims filer (supplerende figur 1A)
- Åbn kameraets software skal du klikke på Filer og derefter Batch Converter.
- Klik på Tilføj filer, og vælg den første fil i den første position. Gentag for hver position.
- For hver fil uploadet, skal du klikke på Indstillinger, og kontroller, at indstillingerne "T" for Time, "C" for kanaler og "Z" for z-stakke vises i den rækkefølge.
- Gem i den ønskede mappe. Gennemse og oprette en ny fil, som konverteres.
- Klik på Sæt for alle og Start.
- Justeringer (supplerende figur 1B)
- Gå ind i den specifikke Konverteret mappe og åbne den første fil.
- I display Justering vindue, justere baggrundensignal cutoff ved at modificere Minimum antal for hver kanal, hvis nødvendigt.
- Om nødvendigt justeres signalintensiteten ved at modificere Max nummer (lavere Max tal, jo højere intensitet af signalet).
BEMÆRK: Regulering af det signal intensitet / kontrast muliggøre højdepunktet i en celle adfærd eller et rum for at få en pænere visualisering. Det ændrer ikke selve resultatet. - Klik på Rediger og billedegenskaber.
- Skift x, y og z-værdier (for et 10X objektiv, x og y = 0,712, z = 8 um, for et 20X objektiv: x og y = 0,36, z = 4 um).
- Klik på alle Ækvidistant at justere tidspunkter. Tilføj startdato og starttidspunkt for overtagelsen. Tilføj slutdato og sluttidspunkt for overtagelsen (supplerende figur 1C).
- Klik på play-knappen for at se filmen.
- Klik på Rediger og Slet tidspunkter at slette uskarpe billeder.
- Hvis du vil deltage to separate opkøb Together i en film, gå til det sidste tidspunkt i den første film, og klik på Rediger> Tilføj tidspunkter for at tilføje den anden fil.
- Lagring som en film (supplerende figur 1D)
- Klik på Optag, vælg .mov udvidelse og en kompression på 0.
- Klik på Gem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af spinning disk konfokal mikroskopi, ikke-tumorale og tumorvæv i tyndtarmen af Apc Min / +; ACTB-ECFP, c-fms-ECFP mus kan visualiseres fra den serøse overflade. Efter billedbehandling, er kamera software, der bruges til at analysere og justere købet (supplerende figur 1). Efter intravenøs (iv) injektion af fluorescerende 2.000 kDa dextran-rhodamin og Ly-6G 647 konjugeret antistof, blodkar og PMN'er kan detekteres (figur 1). Peyerpletter der er aggregeringer af lymfevæv og fuld af myeloide celler kan ses nemt (Figur 1A). Krypter i tyndtarmen er omgivet af blodkar og myeloide celler (figur 1A og 1B). Tumoral væv er ofte mere vaskulariseret og mere infiltreret af myeloide celler og strukturen af krypter er mindre vægtell organiseret (figur 1A og 1B), afhængigt af størrelsen af tumor. Erhvervelse kan ske ved hjælp af en 10X 0,5 NA (figur 1A) og 20x 0,75 NA Fluar linser (figur 1B), men vi opnåede det bedste resultat med 10X 0,5 NA Fluar linse, som var lyse, tilladelse til erhvervelse af en stor region (676 x 676 um) og kunne give billeder fra op til 70 um i vævet. Den glatte muskel lag udtrykker actin-ECFP kan undertiden gøre fokus på tarmepitelet vanskeligt (figur 1B, højre panel). Myeloide celler dynamik i tumorer kan følges i realtid for et par timer, som vist i den animerede / video Figur 2. Betragtninger neutrofiler (GR1 + celler) cirkulerer i blodkarrene og patruljere væv, andre myeloide celler, hovedsageligt makrofager, surround krypter og er mindre motile (Animeret / video figur 2).
Figur 1. Repræsentative billeder opnået med roterende skive konfokale ikke-tumor- og tumoral væv fra APC Min / + mus. (A) Fire-farve-billeder (10x Fluar, 0,5 NA-objektiv) af tyndtarmen epitel fra serøse overflade APC Min / +; ACTB-ECFP; cfms-EGFP mus, der fik iv fluorescerende 2.000 kDa dextran-rhodamin (rød) og Ly-6G 647 konjugeret antistof (hvid). Det venstre panel viser den ikke-tumorale epitel og i højre panel vises en svulst fra samme Apc Min / +; ACTB-ECFP; cfms-EGFP mus. Myeloide celler er grønne og epitelceller er blå. En klynge af c-fms + celler ses i den ikke-tumorale tarmvæv i en Peyers plaster (hvid pil), skala bar = 100 um. (B) Fire-farve-billeder (20X Fluar, 0,5 NAobjektiv) af tyndtarmen epitel fra den serøse overflade af en Apc Min / +; ACTB-ECFP; cfms-EGFP tumor. I det venstre panel er flere dobbelt-positive Gr1 + c-FMS + celler detekteret i tumor væv. Højre panel viser et billede af den glatte muskulatur lag udtrykker actin-ECFP der kan gengive fokus på tarmepitelet svært, skala bar = 50 um.
Animerede / video Figur 2 . Myeloide celle dynamik i en 3 mm adenom fra en APC Min / + mus. Fire farve time-lapse af tyndtarmen epitel (10X Fluar, 0,5 NA objektiv) fra serøse overflade af en Apc Min / + ; ACTB-ECFP; cfms-EGFP mus co-injiceret med fluorescerende 2.000 kDa dextran-rhodamin (rød) og en Ly-6G 647 konjugeret antistof (hvid). Myeloide celler er grønne ogepitelceller er blå. Myeloide celler omkring krypter ikke bevæger sig. Nogle neutrofiler (Gr1 + celler i hvid) patruljerer i vævene. Dette er en 2 timers erhvervelse og filmen er drønede op 295 gange.
Supplerende Figur 1 . skærmbilleder af kameraets software til erhvervelse analyse. (A) Først skal omdannes til .ims udvidelse filerne. (B) Derefter kan vise billeder justeres, såsom specifikke signaler kan øges og baggrund faldt . (C) Dato og klokkeslæt skal tilpasses med henblik på at få en real-time film. (d) erhvervelsen kan gemmes som en film.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette papir, er en detaljeret protokol beskrevet for spinning disk konfokal billeddannelse af myeloide celle dynamik i tarm tumorer i flere timer i et levende dyr, afbildet fra serøse side af tarmen.
For at undgå betændelse og at have optimale fysiologiske betingelser, billeddannelse af tarmen skal ske på den intakte organ. Billeddannelse fra serøse side af tarmen er imidlertid en udfordring, fordi lyset skal gå gennem forskellige vævslag såsom glat muskel, før de når epitel. Fokus på epitel kan være svært på nogle områder, især i actin-ECFP reporter mus, da actin er stærkt udtrykt af glatte muskelceller. Selv om to-foton mikroskopi har den fordel dybere vævspenetration sammenlignet med konfokale mikroskoper, fandt vi, at den roterende skive konfokalt mikroskop er kraftig nok til at opnå en god visualisering af den intestinale epitel struktur. Fordelene of roterende skive mikroskopi omfatter kapacitet til meget hurtigt at tilegne og unik følsomhed uden at ofre konfokal opløsning. Disse egenskaber tillader observation af dynamiske processer selv om nogle tidspunkter skal slettes på grund af bevægelse artefakter, minimere solskader og aktivere billeddannelse relativt svagt fluorescerende molekyler.
Imaging tarmen fra serøse side kan også være en udfordring på grund af de endogene peristaltiske bevægelser dette organ. I denne protokol, er en sc injektion af atropin gives før billedbehandling, og det effektivt reducerer bevægelsen. Det er imidlertid vigtigt at bemærke, at peristaltisk bevægelse er mere omfattende i tyktarmen, men er ikke godt inhiberes af atropin behandling gør billeddannelse ganske vanskeligt i denne del af tarmen. Den glatte muskel lag i tyktarmen er noget mere fremtrædende c ompared til tyndtarmen og synes at være flere kontraktile. Derfor er deter næsten umuligt at fokusere på epitelet i actin-ECFP reporter mus. Endvidere, ud over disse endogene bevægelser kan orgel drivende forekomme, men i denne bageste afdrift korrektion tilfælde kan udføres ved hjælp af kameraet software.
En anden stor udfordring i invasive billeddannelse eksperimenter er at holde musen i live og sunde så længe som muligt under anæstesi. Tarmen er nået ved at åbne bughulen. Således procedure er mere invasiv end den, der anvendes til brysttumor billeddannelse, hvilket kan gøres i op til 40 timer på grund af integriteten af bughinden. Den maksimale købet gjort med bughulen åbnet var 6 timer, men musen var stadig i live med ingen tydelige tegn på lidelse, så endnu længere virksomhedsovertagelse kan være mulig.
I denne undersøgelse myeloid celle adfærd kan følges og analyseres inden for tarm tumor ved hjælp af fluorescerende reporter mus og også fluorokromkonjugerede tracere eller antistoffer. Denne fremgangsmåde kan også anvendes til at observere andre celletyper såsom tregs, dendritiske celler eller fibroblaster ved hjælp Foxp3-EGFP eller CD11c-DTR-EGFP eller Fsp1-EGFP reporter mus henholdsvis, som det har været anvendt i brysttumor undersøgelse 6 . Desuden kan fluorescerende antistoffer mod andre cellepopulationer end neutrofiler injiceres iv Derudover kan celleadfærd også analyseres i forskellige betingelser, såsom hypoksi. Sådanne forsøg kan give ny indsigt i adfærd af disse stroma celler efter behandling med kemoterapi eller målrettet terapi. Endelig kan denne protokol anvendes i andre musemodeller for tarmkræft og i forskellige stadier af tumorprogression. APC Min / + mus kun udvikle tarm adenomatøs polypper, som ikke kommer frem til at malignitet fordi musene har en kortere levetid. Det vil være interessant at studere dynamikken i myeloide celler i andre tarm kræft-modeller med mere aggressive og invasive tumorer, såsom mus, der bærer mutationer i K-ras 19-21 eller Smad4 22 gener i tillæg til APC mutationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Ying Yu for APC MIN / + mus genotypebestemmelse. Denne undersøgelse blev støttet af midler fra INSERM og tilskud (CA057621 og AI053194) fra National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ApcMin/+ mice | Jackson Laboratory | 2020 | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 3773 | |
| cfms-EGFP mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| 2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated | Invitrogen | D7139 | |
| Isoflurane | Butler Animal Health Supply | 29450 | |
| Nitrogen | UCSF | ||
| Oxygen | UCSF | ||
| 1x PBS | UCSF cell culture facility | ||
| Saline Buffer | UCSF cell culture facility | ||
| Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647 | UCSF Monoclonal antibody core | Stock 1 mg/ml. Use at 7 μg/mouse | |
| Atropine | LARC UCSF | Use at 1 mg/kg mouse | |
| Alcohol wipes | Becton Dickinson | 326895 | |
| 28 G x 1/2 in. insulin syringe | Becton Dickinson | 329465 | |
| Remium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5M | 24x50-1 |
| Betadine | LARC UCSF | ||
| Heat blanket | Gaymar Industries | ||
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn ON 30 min before use |
| Cotton tipped apllicators 6-inch | Electron Microscopy Sciences | 72310-10 | |
| Anesthesia system | Summit Anesthesia Support | ||
| Inverted microscope | Carl Zeiss Inc | Zeiss Axiovert 200M | |
| Stage insert | Applied Sientific Instrumentation | ||
| Mouse Ox oximeter, software and sensors | Starr Life Sciences | MouseOx | |
| Nebulizer | Summit Anesthesia Support | ||
| Imaris | Bitplane | ||
| μManager | Vale lab, UCSF | Open-source software | |
| ICCD camera | Stanford Photonics | XR-Mega-10EX S-30 | |
| Spinning disk confocal sacan-head | Yokogawa Corporation | CSU-10b |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Schouppe, E., De Baetselier, P., Van Ginderachter, J. A., Sarukhan, A. Instruction of myeloid cells by the tumor microenvironment: Open questions on the dynamics and plasticity of different tumor-associated myeloid cell populations. Oncoimmunology. 1 (7), 1135-1145 (2012).
- Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism. Dev Cell. 18 (6), 884-901 (2010).
- Lohela, M., Werb, Z. Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 72-78 (2010).
- Egeblad, M., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1 (2-3), discussion 165 155-167 (2008).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), pdb top97 (2011).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), pdb prot5563 (2011).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), pdb prot5562 (2011).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (73), e50088 (2013).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Walther, A., et al. Genetic prognostic and predictive markers in colorectal cancer. Nat Rev Cancer. 9 (7), 489-499 (2009).
- Fearon, E. R.
- Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science. 247 (4940), 322-324 (1990).
- Su, L. K., et al. Multiple intestinal neoplasia caused by a mutation in the murine homolog of the APC gene. Science. 256 (5057), 668-670 (1992).
- Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
- McDole, J. R., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).
- Xu, C., Shen, Y., Littman, D. R., Dustin, M. L., Velazquez, P. Visualization of mucosal homeostasis via single- and multiphoton intravital fluorescence microscopy. J Leukoc Biol. 92 (3), 413-419 (2012).
- Haigis, K. M., et al. Differential effects of oncogenic K-Ras and N-Ras on proliferation, differentiation and tumor progression in the colon. Nat Genet. 40 (5), 600-608 (2008).
- Sansom, O. J., et al. Loss of Apc allows phenotypic manifestation of the transforming properties of an endogenous K-ras oncogene in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (38), 14122-14127 (2006).
- Janssen, K. P., et al. APC and oncogenic KRAS are synergistic in enhancing Wnt signaling in intestinal tumor formation and progression. Gastroenterology. 131 (4), 1096-1109 (2006).
- Takaku, K., et al. Intestinal tumorigenesis in compound mutant mice of both Dpc4 (Smad4) and Apc genes. Cell. 92 (5), 645-656 (1998).
