En enkel Kritisk stora Femoral Defect Model hos möss

Summary

Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice.

Abstract

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all limb bone fractures fail to heal completely due to the extent of the trauma, disease, or age of the patient. Our ability to improve bone regenerative strategies is critically dependent on the ability to mimic serious bone trauma in test animals, but the generation and stabilization of large bone lesions is technically challenging. In most cases, serious long bone trauma is mimicked experimentally by establishing a defect that will not naturally heal. This is achieved by complete removal of a bone segment that is larger than 1.5 times the diameter of the bone cross-section. The bone is then stabilized with a metal implant to maintain proper orientation of the fracture edges and allow for mobility.

Due to their small size and the fragility of their long bones, establishment of such lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. As such, long bone defect models are confined to rats and larger animals. Nevertheless, mice afford significant research advantages in that they can be genetically modified and bred as immune-compromised strains that do not reject human cells and tissue.

Herein, we demonstrate a technique that facilitates the generation of a segmental defect in mouse femora using standard laboratory and veterinary equipment. With practice, fabrication of the fixation device and surgical implantation is feasible for the majority of trained veterinarians and animal research personnel. Using example data, we also provide methodologies for the quantitative analysis of bone healing for the model.

Introduction

Det uppskattas att hälften av den amerikanska befolkningen upplever en fraktur vid en ålder av 65 ^1. För de patienter med frakturer behandlas kirurgiskt, 500.000 förfaranden innebär användning av en bentransplantation ² och denna siffra väntas stiga med en alltmer åldrande befolkning ³ . Även ben är en av de få organ som har kapacitet att helt läka utan ärrbildning, det finns fall där processen misslyckas ^3,4. Beroende på omständigheterna och behandlingskvalitet, 2-30% av långa benfrakturer misslyckas, vilket resulterar i icke-fackligt ^3,5. Medan det fortfarande viss debatt om definition, pseudoartros, kritiska stora eller icke-fackligt benskador generellt hänvisar till en skada som inte läker över naturliga livslängd ämnet ^6. I experimentsyfte, detta varaktighet förkortas till den genomsnittliga tid som krävs för fullständig läkning av en medelstor benskada. Icke fackliga benlesioner uppstå av numerous skäl, men viktiga faktorer inkluderar extrem trauma som resulterar i ett kritiskt stort gap, infektion, dålig angiogenes, tobaksbruk, eller hämmade osteoregenerative kapacitet på grund av sjukdom eller ⁷ års ålder. Även om icke-fackföreningarna framgångsrikt behandlas, kan det kosta över $ 60.000 per förfarande, beroende på typ av skada och de metoder som används ^8.

I måttliga fall autolog bentransplantation anställd. Denna strategi innebär återvinning av ben från en donator webbplats och implantation på platsen för skadan. Även om detta tillvägagångssätt är extremt effektiv, är volymen av tillgänglig donator-derived ben begränsad och förfarandet innebär en ytterligare operation, vilket resulterar i ihållande smärta hos många patienter ^9,10. Dessutom är effekten av den autologa bentransplantat beroende av patientens hälsa. Benersättningar gjorda av syntetmaterial eller bearbetat avliden ben finns i riklig mängd ^11-13, men de HAve betydande begränsningar, inklusive dåliga värdcellsvidhäftningsegenskaper, reducerad osteokonduktivitet och potentialen för avstötning ^14. Det finns därför ett akut behov för benuppbyggnad teknik som är säker, effektiv och allmänt tillgängliga.

Vår förmåga att förbättra ben regenerativa strategier är kritiskt beroende av förmågan att härma allvarlig skelettskada i försöksdjur, men generering och stabilisering av stora benlesioner är tekniskt utmanande. I de flesta fall är allvarliga rörben trauma härmas experimentellt genom att upprätta ett fel som inte kommer naturligt läka. Även om det kan variera med arter ^15, uppnås detta genom fullständigt avlägsnande av ett ben segment som är större än 1,5 gånger diametern på benet tvärsnittet ^16. Benet stabiliseras sedan med ett metallimplantat för att bibehålla korrekt orientering av brottkanter och möjliggöra rörlighet. På grund av sin ringa storlek och bräcklighetsina långa ben, inrättandet av sådana lesioner i möss är bortom kapaciteten hos de flesta forskargrupper. Som sådan är långa ben defekt modeller begränsas till råttor och större djur. Ändå möss ger betydande forskningsfördelar genom att de kan genetiskt modifierade och uppvuxna som immunkomprometterade stammar som inte förkastar mänskliga celler och vävnader.

För humana cellbaserade applikationer, immunkomprometterade möss är attraktivt att arbeta med eftersom de är fysiologiskt väldefinierad, lätt att huset, kostnadseffektivt och enkelt analyseras radiologiskt och histologiskt. Av största vikt är att immunkomprometterade möss inte avvisa celler från olika arter, inklusive människan. Deras ringa storlek tillåter också testning av ett mycket litet antal celler eller volymer experimentella byggnadsställningar i ortopediska applikationer. Flera murina ortopediska modeller har rapporterats att ge olika grader av ben stabilitet ^17,18. De systemams som resulterar i mycket höga halter av stabilitet, såsom externa fixators och låsanplattor läka främst genom intramembranös benbildning trots endokondral läkning har rapporterats ^19. Däremot de som tillåter vissa mikro- och / eller makro rörelse, till exempel de som använder ofixerade eller delvis fasta medullära stift, vanligen läker med en dominans av endokondral benbildning ^20,21. Fördröjd union eller icke fackligt defekter av långa ben är särskilt svårt att uppnå i möss på grund av den extra nivå av stabilisering krävs. Dock har ett antal metoder rapporterats, inklusive märg stift med samverkande spikar, låsbara plattor och externa fixators ^22. Dessa system fungerar i allmänhet väl, men med tanke på deras komplicerade konstruktion kan de vara tekniskt utmanande att installera. Till exempel, al. Garcia et ²³ utarbetat en elegant samverkande stift för användning i möss, men förfarandet innebär snitt på två separat webbplatss och omfattande modifiering av lårbenet för att rymma stiften. Dessa procedurer utfördes under ett dissektionsmikroskop.

Häri beskriver vi en enkel lårbensmärg stift med en central krage utformats för att förhindra stängning av en 3 mm underskott ben och även beskriva de ursprungliga kanter defekten. Medan stiftet inte var fast till själva benet, att exakt dimensionering av stiftdiameter och brotschning av märghålan resulterar i tillräcklig interferens minimerar torsionsrörelse (Figur 1). Genom ett noggrant urval av inavlade ålder, kön och stam matchade möss, är resultatet en mycket reproducerbar hypertrofisk icke-uniondefect ²² som lätt kan utvärderas radiologiskt. Dessutom regioner av intresse kan reproducerbart definieras efter mikro datortomografi (μCT) för mätning av de novo benbildning och histomorphological parametrar. Stiften var prototyper i vårt laboratorium med hjälp av lättillgängliga verktyg.

Figur 1: Experimentell princip Schematisk sammanfattning av den segmentdefekt modellen.. Det centrala 3 mm segment av en 9-10 mm murin lårben skärs kirurgiskt (vänster). En 3 mm långa, 19 gauge kirurgiskt stål röret bringas att passera över en 9 mm lång, 22 G-rostfritt stålrör och fixeras med bindemedel vid den exakta centrum (höger). Den erhållna stiftet är monterat i medullära kanalerna i de återstående proximala och distala delarna av lårbenet med 19 G kragen ersätter den 3 mm segment av ben (nedan, mitten).

Protocol

OBS: Detta protokoll är utformad för kvinnlig naken (Nu / J) möss (18-25 g, 6 veckor) förvärvats från Jackson Laboratories. Eftersom stammar av möss variera något i termer av anatomi och tillväxttakt, rekommenderar vi att tillverkningen av stiften är optimerad för stammen, kön och ålder av mottagarna före implantering i levande individer. Om stammarna är noggrant matchas, är presspassningen mellan stiftet och märghålighet mycket reproducerbar. Rutiner för bostäder, kost och allmän djurhållning är …

Representative Results

Möss återhämtar normalt medvetande och hind-lem rörlighet 5-10 minuter efter indragning av anestesi. Under de första fem dagarna, är det lämpligt att hysa möss individuellt och införa miljöberikning för att förhindra överskott användning av lemmen. För detta ändamål igloo-typ bon minska behovet av bobyggande och uppmuntra vila. Vi har också observerat att tillhandahålla livsmedel och hydrogel på golvet av buren minskar sannolikheten för stiftet deplacement. Under 5-dagars period, bör smärtlindring…

Discussion

Häri beskriver vi en enkel metod för att generera en kritisk storlek stift stabiliserade defekten av den murina lårbenet med användning av standardlaboratorie och veterinärmedicinsk utrustning. Medan montering av stiften och det kirurgiska ingreppet i sig kräver praktiken är det väl inom funktionerna i en välutbildad biomedicinsk forskare eller veterinär.

Stiftet placeras i medullära kanalen utan ytterligare fixering, vilket gör proceduren tekniskt mer genomförbart än mer kompl…

Materials

Name of Equipment/Material*	Company	Catalog or model	Notes
Pin Assembly
Dremel rotary tool	Dremel	8220	or equivalent
Heavy duty cut off wheel	Dremel	420
Surgical tubing 19G	Small Parts (Amazon)	B000FMZ8LY	OD 1.07mm, ID 0.889mm
Surgical tubing 21G	Small Parts (Amazon)	B000FMZ8YQ	OD 0.82mm, ID 0.635mm
Surgical tubing 22G	Small Parts (Amazon)	B000FMYLZS	OD 0.719mm, ID 0.502mm
Surgical tubing 23G	Small Parts (Amazon)	B000FN0SY0	OD 0.643mm, ID 0.444mm
Cyanoacrylate adhesive	Loctite	1365882
Emery disc	Dremel	413
Rubber polishing point	Dremel	462
Felt polishing disc	Dremel	414
Gelatin sponge	Surgifoam/Ethicon	1974
Punch biopsy cutter	Miltex	33-34
Surgery/post-operative
Warm pad and circulator pump	Stryker/Thermocare	TP700, TP700C, TPP722
Coverage quaternary spray	Steris	1429-77
Bead sterilizer	Germinator/CellPoint Scentific	Germinator 500
Anesthesia system	VetEquip Inc	901806 or 901807/901809
Isofluorane anesthetic	VETone/MWI	501017, 502017
Surgical disinfectant	Chloraprep/CareFusion	260449
Surgical tools	Fine Science Tools	various	recommend German made
Face protection	Splash Shield	4505
Rechargable high speed drill	Fine Science Tools	18000-17
Diamond cutting wheel	Strauss Diaiond	361.514.080HP
Absorbable sutures	Covidien	UM-213
Outer sutures	Ethicon	668G	or equivalent
Vetbond	3M	1469SB	or equivalent
Hydration gel	Clear H2O	70-01-1082
Diet gel	Clear H2O	72-01-1062
Buprenorphine	Reckitt and Benckser	12496-0757-01	controlled substance
Mouse igloos	Bio Serv	K3328, 3570,3327
Euthanasia cocktail	Euthasol/Virbac	710101	controlled substance
Analysis
Live animal imager	Orthoscan	FD Pulse	or equivalent
Micro-CT unit and software	Bruker	Skyscan1174	or equivalent
Sealing film/Parafilm M	VWR or Fisher	100501-338, S37441
*Generic sources are suitable for all other items such as gause, drapes, protective clothing, animal care equipment.