الجهد والكالسيوم مزدوجة القناة البصرية رسم خرائط مثقف HL-1 الرجفان العضلية واحد رقائق
Summary
This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.
Abstract
وقد ثبت رسم الخرائط الضوئية لتكون تقنية قيمة للكشف عن النشاط الكهربائي في القلب على حد سواء سليمة خارج الحي قلوب والطبقات الوحيدة العضلية مثقف. وقد استخدمت على نطاق واسع خلايا HL-1 كنموذج الخلوي 2-الأبعاد لدراسة الجوانب المختلفة لعلم وظائف الأعضاء القلب. ومع ذلك، فقد كان تحديا كبيرا لخريطة بصريا الكالسيوم (الكالسيوم) العابرين وإمكانات العمل في وقت واحد من نفس مجال الرؤية في تربيتها HL-1 خلية الأذيني أحادي الطبقة. هذا هو لأنه مطلوب معالجة خاصة والرعاية لإعداد الخلايا السليمة التي يمكن أن يتم القبض كهربائيا وتعيين بصريا. لذلك، قمنا بتطوير بروتوكول العمل الأمثل لالمزدوج رسم الخرائط البصرية القناة. في هذه المخطوطة، التي وصفناها بالتفصيل كيفية تنفيذ القناة التجربة رسم الخرائط الضوئية المزدوجة. هذا البروتوكول هو أداة مفيدة لتعزيز مفهوم العمل نشر المحتملين وحركية الكالسيوم في التنمية عدم انتظام ضربات القلب.
Introduction
والكالسيوم فريد (كاليفورنيا) والجهد (V م) المزدوج رسم الخرائط الضوئية قنوات تقنية 1-5 يبرز بوصفه أداة فعالة لتسجيل وقت واحد V م والكالسيوم إشارات في كل من قلوب سليمة والطبقات الوحيدة الخلية مثقف. هذا الأسلوب يجعل من الممكن الحصول على معلومات قوية بشأن العلاقة بين العابرين الكالسيوم وإمكانات العمل لفهم أفضل للآليات الكهربية الكامنة وراء عدم انتظام ضربات القلب.
وقد أثبتت الطبقات الوحيدة خلايا مستنبتة لتكون نموذجا الخلوي المفيد دراسة الكهربية القلب وآلية الكامنة وراء عدم انتظام ضربات القلب. 4،6-8 HL-1 الخلايا العضلية هي الأذيني خط ثقافة تتميز بشكل جيد. خلايا HL-1 أيضا الحفاظ على النمط الجيني متباينة بشكل فريد والنمط الظاهري الذي يتضمن المورفولوجي، الكهربية، والخصائص الدوائية من myocytes الأذيني الكبار. هذه الخلايا تعبر عن الجينات والبروتينات القلب، بما في ذلك importaالإقليم الشمالي القنوات الأيونية القلب (أي L- وقنوات الكالسيوم T-نوع) 9 و الإسوية ناضجة من البروتينات مقلص الساركومير توجد عادة في myocytes الأذيني الكبار مثل الآخرين ولقد ذكرت سابقا. 10-13 وبالإضافة إلى ذلك، يمكن HL-1 خلايا يكون مثقف لتشكيل 2-الأبعاد (2-D) العضلية أحادي الطبقة. وهكذا، فإن مزايا استخدام مثقف الطبقات الوحيدة HL-1 ما يلي: 1) أقل نسبيا من حيث التكلفة وأسهل للحفاظ على خط الثقافة العضلية من عزل وزراعة myocytes حديثي الولادة الأولية؛ 2) أحادي الطبقة متموجة من الخلايا يقلل من التعقيدات الهيكلية التي تنجم عن هيكل 3-D من القلب؛ 3) يمكن أحادي الطبقة خلية القضاء على التدخل من التليف الخلالي الذي يحدث في قلب سليمة. وهذا يمكن أن تستخدم لتشريح وظائف الكهربية محددة من مجموعة من myocytes دون تدخل من الخلايا الليفية ومصفوفة الخلالي. 4) تقييم عواقب وظيفية من التلاعب الدوائي أو الوراثي في طريق مسدودالطبقات الوحيدة الخلية بناءه من جديد يمكن أن يتحقق على نحو فعال. لذلك، أصبحت HL-1 خلايا نموذجا الخلوية المستخدمة على نطاق واسع لدراسة الجوانب المختلفة لعلم وظائف الأعضاء العضلية وكذلك الأنشطة الكهربائية غير الطبيعية الناجمة عن سرعة. 13-16 ومع ذلك، لا بد من معالجة خاصة ورعاية للثقافة الطبقات الوحيدة الخلية الصحيحة التي تستجيب للخارجية سرعة الكهربائية للدراسات رسم الخرائط البصرية. وبالإضافة إلى ذلك، قد المزدوج الفلورسنت الإجراء صبغ تلطيخ تلف بسهولة على سلامة مثقف الطبقات الوحيدة الخلية متموجة. وهكذا، فقد كان أداء V م / CA قناة مزدوجة رسم الخرائط البصرية في تربيتها HL-1 الطبقات الوحيدة تحديا كبيرا.
والهدف من هذه الطريقة هو توفير الخطوات الرئيسية لأداء بنجاح المزدوج رسم الخرائط الضوئية القنوات في تربيتها HL-1 الطبقات الوحيدة. نحن هنا قدمت تفاصيل واسعة على بروتوكول الأمثل لإعداد أحادي الطبقة HL-1 خلية، المزدوج رسم الخرائط البصرية قناة أحادي الطبقة خلايا مستنبتة، ومعالجة البيانات ورسم الخرائط.
Protocol
Representative Results
Discussion
توضح هذه المقالة الجوانب الرئيسية لرسم الخرائط البصرية في تربيتها HL-1 الأذيني العضلية أحادي الطبقة ملطخة الكالسيوم والجهد الأصباغ الفلورية الحساسة. يشمل ذلك زراعة والأمثل HL-1 أحادي الطبقة الخلية، والإعداد للمعدات رسم الخرائط، ورسم خرائط أحادي الطبقة المثقفة، وتحلي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر الدكتور Claycomb لتوفير خلايا HL-1 و بروتوكول مفصل صيانة. كما نود أن نشكر السيدة ايلينا كاريو والدكتور سيث Robia على المساعدة التي قدموها مع توليد الفيلم الخلية والسيد بيت كارون لمساعدته مع جعل بعض الملحقات لدينا مزدوج نظام رسم الخرائط البصرية القناة.
وأيد هذا العمل من قبل جمعية القلب الأمريكية (10GRNT3770030 و12GRNT12050478 إلى XA)، المعاهد الوطنية للصحة (HL113640 إلى XA)، وصندوق لويولا جامعة بحوث التنمية (لXA).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Rhod2 dry powder | AAT Bioquest | 21062 | |
| pluronic | AAT Bioquest | 20050 | |
| DMSO | sigma | 276855 | |
| Rh237 | Invitrogen | S-1109 | |
| NaCl | sigma | S7653 | |
| KCl | sigma | P3911 | |
| KH2PO4 | sigma | P0662 | |
| NaH2PO4 | sigma | S9638 | |
| MgSO4 | sigma | M7506 | |
| D-Glucose | sigma | G8270 | |
| NaHCO3 | sigma | S6014 | |
| CaCl2 | sigma | C3881 | |
| HEPEs | sigma | H3375 |
References
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).
- Salama, G., Hwang, S. M., et al. Simultaneous optical mapping of intracellular free calcium and action potentials from Langendorff perfused hearts. Current protocols in cytometry / editorial board, J. Paul Robinson, managing editor … [et al.]. 12 (Unit 12 17), (2009).
- Laurita, K. R., Singal, A. Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 280 (5), H2053-H2060 (2001).
- Fast, V. G. Simultaneous optical imaging of membrane potential and intracellular calcium. J Electrocardiol. 38 (4 Suppl), 107-112 (2005).
- Sowell, B., Fast, V. G. Ionic mechanism of shock-induced arrhythmias: role of intracellular calcium. Heart Rhythm. 9 (1), 96-104 (2012).
- Fast, V. G., Kleber, A. G. Microscopic conduction in cultured strands of neonatal rat heart cells measured with voltage-sensitive dyes. Circ Res. 73 (5), 914-925 (1993).
- Hou, L., et al. A major role for HERG in determining frequency of reentry in neonatal rat ventricular myocyte monolayer. Circ Res. 107 (12), 1503-1511 (2010).
- Beauchamp, P., et al. Relative contributions of connexins 40 and 43 to atrial impulse propagation in synthetic strands of neonatal and fetal murine cardiomyocytes. Circ Res. 99 (11), 1216-1224 (2006).
- Xia, M., et al. Functional expression of L- and T-type Ca2+ channels in murine HL-1 cells. J Mol Cell Cardiol. 36 (1), 111-119 (2004).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (6), 2979-2984 (1998).
- Fahrenbach, J. P., Ai, X., Banach, K. Decreased intercellular coupling improves the function of cardiac pacemakers derived from mouse embryonic stem cells. J Mol Cell Cardiol. 45 (5), 642-649 (2008).
- Yan, J., et al. c-Jun N-terminal kinase activation contributes to reduced connexin43 and development of atrial arrhythmias. Cardiovasc Res. 97 (3), 589-597 (2013).
- White, S. M., Constantin, P. E., Claycomb, W. C. Cardiac physiology at the cellular level: use of cultured HL-1 cardiomyocytes for studies of cardiac muscle cell structure and function. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), H823-H829 (2004).
- Yang, Z., Shen, W., Rottman, J. N., Wikswo, J. P., Murray, K. T. Rapid stimulation causes electrical remodeling in cultured atrial myocytes. J Mol Cell Cardiol. 38 (2), 299-308 (2005).
- Brundel, B. J., Kampinga, H. H., Henning, R. H. Calpain inhibition prevents pacing-induced cellular remodeling in a HL-1 myocyte model for atrial fibrillation. Cardiovasc Res. 62 (3), 521-528 (2004).
- Umapathy, K., et al. Electrogram fractionation in murine HL-1 atrial monolayer model. Heart Rhythm. 5 (7), 1029-1035 (2008).
- Fast, V. G., Cheek, E. R. Optical mapping of arrhythmias induced by strong electrical shocks in myocyte cultures. Circ Res. 90 (6), 664-670 (2002).
- Bayly, P. V., et al. Estimation of conduction velocity vector fields from epicardial mapping data. IEEE Trans Biomed Eng. 45 (5), 563-571 (1998).
