Tension et calcium double cartographie de canal optique de Cultured HL-1 auriculaire myocytes monocouche
Summary
This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.
Abstract
Cartographie optique se est avérée être une technique utile pour détecter l'activité électrique cardiaque à la fois ex vivo intact cœurs et dans des monocouches de myocytes cultivés. cellules HL-1 ont été largement utilisés comme un modèle cellulaire 2 dimensions pour étudier divers aspects de la physiologie cardiaque. Cependant, il a été un grand défi à la carte optiquement calcium (Ca) transitoires et potentiels d'action simultanément à partir du même champ de vision dans une culture cellulaire HL-1 auriculaire monocouche. Ce est parce que la manipulation spéciale et de soins est nécessaire pour préparer les cellules saines qui peuvent être capturées électriquement et optiquement mappés. Par conséquent, nous avons développé un protocole de travail optimal pour la cartographie optique double canal. Dans ce manuscrit, nous avons décrit en détail comment réaliser l'expérience de cartographie optique double canal. Ce protocole est un outil utile pour améliorer la compréhension de l'action potentielle propagation et la cinétique Ca dans le développement de l'arythmie.
Introduction
Un uniques calcium (Ca) et la tension (V m) technique de cartographie optique double canal 1-5 est en train de devenir un outil efficace pour enregistrer simultanément V m et Ca signaux dans les deux coeurs intacts et des monocouches de cellules cultivées. Cette technique permet d'obtenir des informations puissante concernant la relation entre les transitoires de calcium et potentiels d'action afin de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents électrophysiologiques d'arythmies cardiaques.
Des monocouches de cellules cultivées se sont avérés être un modèle utile pour étudier cellulaire électrophysiologie cardiaque et le mécanisme sous-jacent d'arythmies. 4,6-8 HL-1 sont des cellules d'une ligne de culture des myocytes auriculaires bien caractérisé. cellules HL-1 maintiennent également un génotype et le phénotype différencié unique qui comprend morphologique, électrophysiologique, et les caractéristiques pharmacologiques de myocytes auriculaires adultes. Ces cellules expriment des gènes et des protéines cardiaques, y compris important canaux ioniques cardiaque (ce est à dire, L et canaux calciques de type T) 9 et matures isoformes de protéines contractiles sarcomériques trouvent normalement dans les myocytes auriculaires adultes que les autres et nous avons indiqué précédemment. 10-13 En outre, HL-1 cellules peuvent être cultivées pour former un 2 dimensions (2-D) myocytes monocouche. Ainsi, les avantages de l'utilisation de culture des monocouches de HL-1 comprennent: 1) coût relativement bas et plus facile à maintenir une ligne de la culture des myocytes que d'isoler et cultiver les myocytes néonataux primaires; 2) une monocouche confluente de cellules réduit la complexité de structure qui résultent de la structure 3-D du coeur; 3) une monocouche cellulaire peut éliminer l'interférence de la fibrose interstitielle qui se produit dans le coeur intact. Ceci peut être utilisé pour disséquer les fonctions électrophysiologiques spécifiques d'un groupe de myocytes sans interférence des fibroblastes et la matrice interstitielle; 4) l'évaluation des conséquences fonctionnelles de la manipulation pharmacologique ou génétique en culmonocouches de cellules turés peuvent être effectivement atteints. Par conséquent, HL-1 cellules sont devenues un modèle cellulaire largement utilisé pour étudier divers aspects de la physiologie myocytes ainsi que les activités électriques anormales induite stimulation. 13-16 Cependant, un traitement spécial et des soins est requis à la culture des monocouches de cellules saines qui répondent à l'extérieur la stimulation électrique pour les études de cartographie optiques. En outre, double procédure colorant fluorescent coloration peut facilement endommager l'intégrité des monocouches de cellules confluentes cultivées. Ainsi, l'exécution V m / CA double canal cartographie optique de culture HL-1 monocouches a été un grand défi.
L'objectif de cette méthode est de fournir les étapes clés pour effectuer avec succès cartographie optique double canal en culture HL-1 monocouches. Ici, nous avons fourni de nombreux détails sur un protocole optimisé pour une préparation monocouche HL-1 de la cellule, cartographie optique à deux canaux d'une monocouche de cellules cultivées, et le traitement des données de cartographie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article décrit les aspects clés de la cartographie optique dans une culture HL-1 auriculaire myocytes monocouche colorées avec calcium et de tension colorants fluorescents sensibles. Il comprend la culture d'un HL-1 monocouche cellulaire optimale, la configuration de l'équipement de la cartographie, la cartographie d'une monocouche de culture, et l'analyse des données.
Pour cartographier avec succès des cellules en culture, l'essentiel est de préparer une monoc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier le Dr Claycomb pour fournir des cellules HL-1 et le protocole d'entretien détaillé. Nous tenons également à remercier Mme Elena Carrillo et le Dr Seth Robia pour leur aide à générer le film cellulaire et M. Pete Caron pour son aide à la rédaction des accessoires pour notre double système de cartographie optique canal.
Ce travail a été soutenu par l'American Heart Association (10GRNT3770030 & 12GRNT12050478 à XA), National Institutes of Health (HL113640 à XA), et le Fonds de l'Université Loyola de recherches pour le développement (à XA).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Rhod2 dry powder | AAT Bioquest | 21062 | |
| pluronic | AAT Bioquest | 20050 | |
| DMSO | sigma | 276855 | |
| Rh237 | Invitrogen | S-1109 | |
| NaCl | sigma | S7653 | |
| KCl | sigma | P3911 | |
| KH2PO4 | sigma | P0662 | |
| NaH2PO4 | sigma | S9638 | |
| MgSO4 | sigma | M7506 | |
| D-Glucose | sigma | G8270 | |
| NaHCO3 | sigma | S6014 | |
| CaCl2 | sigma | C3881 | |
| HEPEs | sigma | H3375 |
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