Spannung und Calcium Dual Channel Optical Mapping von Cultured HL-1 Vorhofmuskelzellen Monolayer
Summary
This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.
Abstract
Optische Abbildungs hat sich als eine wertvolle Technik, um die elektrische Herzaktivität sowohl intakte ex vivo Herzen und in kultivierten Myozyten-Monoschichten zu erkennen. HL-1-Zellen wurden in großem Umfang als ein 2-dimensionales zelluläres Modell zur Untersuchung diverse Aspekte der Herzphysiologie verwendet. Allerdings war es eine große Herausforderung, optisch Karte Calcium (Ca) Transienten und Aktionspotentiale gleichzeitig über dieselbe Sichtfeld in einer kultivierten HL-1 Vorhofzellmonolayer. Dies liegt daran, eine spezielle Handhabung und Pflege ist erforderlich, um gesunde Zellen, die elektrisch erfasst werden kann und optisch abgebildet vorzubereiten. Wir haben daher eine optimale Arbeitsprotokoll zur zweikanaligen optischen Abbildungs entwickelt. In diesem Manuskript haben wir im Detail beschrieben, wie Sie den Dual-Channel-optische Mapping Experiment durchzuführen. Dieses Protokoll ist ein nützliches Tool, um das Verständnis der Aktionspotentialausbreitung und Ca Kinetik in Arrhythmie Entwicklung zu verbessern.
Introduction
Eine einzigartige Calcium (Ca) und Spannung (V m) Dual-Channel-Mapping-Technik optische 1-5 wird als effizientes Werkzeug, um gleichzeitig aufnehmen V m und Ca-Signale sowohl in intakten Herzen und kultivierten Zellmonoschichten entstehen. Diese Technik ermöglicht es, leistungsfähige Informationen bezüglich der Beziehung zwischen Calciumtransienten und Aktionspotentiale, die zugrunde liegenden Mechanismen der elektro Herzarrhythmien besseres Verständnis zu erhalten.
Kultivierte Zellmonoschichten haben sich als nützliche zelluläre Modell Herz-Elektrophysiologie und den zugrundeliegenden Mechanismus Arrhythmien studieren. 4,6-8 HL-1-Zellen sind eine gut charakterisierte atrialen Myozyten Kulturlinie. HL-1-Zellen halten auch ein einzigartig differenzierte Genotyp und Phänotyp, die morphologischen, elektrophysiologischen und pharmakologischen Eigenschaften von Erwachsenen Vorhofmyozyten umfasst. Diese Zellen exprimieren Herz Gene und Proteine, einschließlich important kardialen Ionenkanäle (dh, L- und T-Typ-Calciumkanäle) 9 und reifen Isoformen sarkomerischen kontraktilen Proteine in der Regel in der Erwachsenen Vorhofmyozyten als Anderen gefunden und wir bereits berichtet haben. 10-13 Zusätzlich HL-1-Zellen sein können kultiviert, um einen 2-dimensionalen (2-D) Myozyten Monoschicht zu bilden. Somit werden die Vorteile der Verwendung von kultivierten HL-1 Monoschichten umfassen: 1) relativ niedrige Kosten und eine einfacher Myozyten Kulturlinie als Isolierung und Kultivierung primärer neonatalen Myocyten zu erhalten; 2) eine konfluente Monoschicht von Zellen verringert die strukturelle Komplexität, die aus dem 3-D-Struktur des Herzens führen; 3) eine Zellschicht kann die Interferenz interstitielle Fibrose, die in der intakten Herzens auftritt eliminieren. Dies kann verwendet werden, um bestimmte elektrophysiologische Funktionen aus einer Gruppe von Myozyten ohne Störung von Fibroblasten und interstitiellen Matrix zu zerlegen ist; 4) Bewertung der funktionellen Konsequenzen von pharmakologischen oder genetische Manipulation in culrierte Zellmonoschichten können effektiv erreicht werden. Deshalb haben HL-1-Zellen zu einem weit verbreiteten Zellmodell zur Untersuchung diverse Aspekte der Myozyten Physiologie sowie Schrittmacher-induzierte abnorme elektrische Aktivitäten. 13-16 ist jedoch eine besondere Handhabung und Pflege der Kultur erforderlich gesunde Zellmonoschichten, die mit externen antworten elektrische Stimulation für die optische Abbildung Studien. Zusätzlich können doppelte fluoreszierende Farbstoff Färbeverfahren leicht zu einer Beschädigung der Integrität der kultivierte konfluente Zellmonoschichten. So Durchführung V m / CA Dual-Channel-optische Abbildung in kultivierten HL-1 Monoschichten war eine große Herausforderung.
Das Ziel dieser Methode ist es, die wichtigsten Schritte für die erfolgreiche Durchführung zweikanaligen optischen Abbildungs in kultivierten HL-1 Monoschichten bereitzustellen. Hier haben wir umfangreiche Informationen zu einem optimierten Protokoll für HL-1-Zellmonolayer Vorbereitung, Dual-Channel-optische Abbildung eines kultivierten Zellschicht und Mapping der Datenverarbeitung zur Verfügung gestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Artikel beschreibt die wichtigsten Aspekte der optischen Abbildung in einer kultivierten HL-1 Vorhof Myozyten-Monolayer mit Kalzium und spannungsempfindlichen fluoreszierenden Farbstoffen gefärbt. Es umfasst das Kultivieren eines optimalen HL-1-Zellmonoschicht, die Konfiguration des Abbildungsausrüstung, Abbilden eines kultivierten Monoschicht, und die Datenanalyse.
Um erfolgreich map kultivierten Zellen, ist der Schlüssel zu einer gleichmäßig verteilten Zellrasen vorzubereiten. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Dr. Claycomb für die Bereitstellung von HL-1 Zellen und detaillierte Wartungsprotokoll zu danken. Wir würden auch gerne an Frau Elena Carrillo und Dr. Seth Robia für ihre Unterstützung bei der Erzeugung der Zell Film und Mr. Pete Caron für seine Unterstützung bei der Herstellung von ein paar Accessoires für unsere Dual-Channel-optische Abbildungssystem danken.
Diese Arbeit wurde von der American Heart Association (10GRNT3770030 & 12GRNT12050478 zu XA), National Institutes of Health (HL113640 XA) und Loyola University Research Development Fund (XA) unterstützt.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Rhod2 dry powder | AAT Bioquest | 21062 | |
| pluronic | AAT Bioquest | 20050 | |
| DMSO | sigma | 276855 | |
| Rh237 | Invitrogen | S-1109 | |
| NaCl | sigma | S7653 | |
| KCl | sigma | P3911 | |
| KH2PO4 | sigma | P0662 | |
| NaH2PO4 | sigma | S9638 | |
| MgSO4 | sigma | M7506 | |
| D-Glucose | sigma | G8270 | |
| NaHCO3 | sigma | S6014 | |
| CaCl2 | sigma | C3881 | |
| HEPEs | sigma | H3375 |
References
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