培養HL-1心房筋細胞単層の電圧とカルシウムデュアルチャネル光学マッピング
Summary
This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.
Abstract
光学的マッピングは、心臓をエクスビボ無傷で培養筋細胞単層の心臓の電気的活動を検出するための有益な手法であることが証明された。 HL-1細胞は、広く、心臓生理機能の多様な側面を研究するための2次元細胞モデルとして使用されてきた。しかし、それは培養されたHL-1心房細胞単層において同じ視野から同時に光学的にマップカルシウム（Ca）過渡と活動電位に大きな課題となっている。特別な取り扱いや注意が電気的捕獲および光学マッピングすることができる健康な細胞を調製するために必要とされるためである。したがって、我々は、デュアルチャネル光学マッピングのための最適な作業プロトコルを開発した。この原稿では、デュアルチャネル光学マッピング実験を実行する方法を詳細に説明してきた。このプロトコルは、不整脈の開発における活動電位の伝播およびCa動態の理解を高めるための便利なツールです。
Introduction
ユニークなカルシウム（Ca）と電圧（V m）のデュアルチャネル光マッピング技術1-5は、同時に完全な心と、培養細胞単層の両方でV mとCaの信号を記録するための効率的なツールとして浮上している。この技術は、より良好な心不整脈の基礎となる電気生理学的メカニズムを理解するために、カルシウムトランジェントと活動電位との間の関係についての強力な情報を得ることができる。
培養された細胞単層は、心臓電気生理学および不整脈の基礎となるメカニズムを研究するための有用な細胞モデルであることが判明している。4,6-8 HL-1細胞を、十分に特徴付けられた心房筋細胞培養株である。 HL-1細胞は、成人の心房筋細胞の形態学、電気生理学的、および薬理学的特性を備えて独自に差別化遺伝子型と表現型を維持する。これらの細胞は、importa含む心臓遺伝子やタンパク質を発現心臓のイオンチャネル（ すなわち 、L-およびT型カルシウムチャネル）9と、通常、他の成人心房筋細胞に見出され、我々が以前に報告したサルコメアの収縮タンパク質の成熟アイソフォームのnt 10〜13に加えて、HL-1細胞とすることができる2次元（2-D）筋細胞の単層を形成するために培養。従って、培養されたHL-1を使用することの利点は、単分子層は、1）比較的低いコストと一次新生筋細胞を単離し、培養するよりも、筋細胞培養株を維持しやすくする。 2）細胞のコンフルエントな単層は、心臓の3次元構造に起因する構造の複雑さを低減する。 3）細胞単層は、無傷の中心部に発生した間質性線維症の干渉を排除することができます。これは、線維芽細胞および間質マトリックスの干渉を受けることなく筋のグループの特定の電気生理学的機能を分析するために使用することができる。 CULにおける薬理学的または遺伝子操作から機能的な結果の4）評価tured細胞単層を効果的に達成することができる。したがって、HL-1細胞は筋細胞生理学の多様な側面だけでなく、ペーシング誘発性の異常な電気的活動を研究するために広く使用されている細胞モデルとなっている。外部に反応する13〜16ただし、特別な取り扱いやケアは文化に必要とされる健康的な細胞単層光学マッピング研究のための電気的ペーシング。また、二重の蛍光色素染色手順は、簡単に培養されたコンフルエント細胞単層の完全性を破損する恐れがあります。このように、培養されたHL-1単層で行うのV M / CAデュアルチャネル光学マッピングは、大きな課題となっている。
この方法の目的は、成功して培養されたHL-1単層においてデュアルチャネル光学マッピングを実行するための重要なステップを提供することです。ここでは、HL-1細胞単層の調製、培養細胞単層のデュアルチャネル光学マッピング、マッピングデータ処理のために最適化されたプロトコルに広範囲の詳細を提供している。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事では、カルシウムや電位感受性蛍光色素で染色した培養されたHL-1心房筋細胞の単層で光学マッピングの重要な側面を説明しています。これは、最適なHL-1細胞単層、マッピング装置のセットアップを培養し、培養単層をマッピングし、データ分析を含む。
成功した培養細胞をマップするには、キーが均一に分布細胞単層を準備することです。カバーガラスの上に…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、HL-1細胞および詳細な保守プロトコルを提供するための博士Claycombに感謝したいと思います。また、当社のデュアルチャネル光学マッピングシステムのためにいくつかのアクセサリーを作るとの彼の援助のための細胞の映画氏とピートキャロンを生成するとの支援のため女史エレナカリージョと博士セスRobiaに感謝したいと思います。
この作品は、（XAに10GRNT3770030＆12GRNT12050478）米国心臓協会、国立衛生研究所（XAにHL113640）、及び（XA）のロヨラ大学の研究開発基金によってサポートされていました。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Rhod2 dry powder | AAT Bioquest | 21062 | |
| pluronic | AAT Bioquest | 20050 | |
| DMSO | sigma | 276855 | |
| Rh237 | Invitrogen | S-1109 | |
| NaCl | sigma | S7653 | |
| KCl | sigma | P3911 | |
| KH2PO4 | sigma | P0662 | |
| NaH2PO4 | sigma | S9638 | |
| MgSO4 | sigma | M7506 | |
| D-Glucose | sigma | G8270 | |
| NaHCO3 | sigma | S6014 | |
| CaCl2 | sigma | C3881 | |
| HEPEs | sigma | H3375 |
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