Tensión y calcio Dual Channel Mapping óptico de Cultivadas HL-1 auricular miocitos monocapa
Summary
This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.
Abstract
Mapeo óptico ha demostrado ser una técnica valiosa para detectar la actividad eléctrica cardiaca tanto intacto ex vivo corazones y en monocapas de miocitos en cultivo. Células HL-1 han sido ampliamente utilizado como un modelo celular 2-Dimensional para el estudio de diversos aspectos de la fisiología cardiaca. Sin embargo, ha sido un gran reto al mapa ópticamente calcio (Ca) los transitorios y los potenciales de acción simultáneamente desde el mismo campo de visión en una culta HL-1 monocapa celular auricular. Esto se debe a que se requiere un manejo y cuidado especial para preparar las células sanas que se pueden capturar eléctricamente y mapeados ópticamente. Por lo tanto, hemos desarrollado un protocolo de trabajo óptimo para el mapeo óptico de doble canal. En este manuscrito, que hemos descrito en detalle cómo realizar el experimento de doble canal mapeo óptico. Este protocolo es una herramienta útil para mejorar la comprensión de la acción potencial de propagación y la cinética de Ca en el desarrollo de arritmias.
Introduction
Una calcio único (Ca) y la tensión (V m) técnica de mapeo óptico de doble canal 5.1 se está convirtiendo en una herramienta eficaz para registrar simultáneamente señales V m y Ca en ambos corazones intactos y monocapas de células cultivadas. Esta técnica hace posible la obtención de información de gran alcance respecto a la relación entre los transitorios de calcio y los potenciales de acción de entender mejor los mecanismos subyacentes electrofisiológicas de las arritmias cardiacas.
Monocapas de células cultivadas han demostrado ser un modelo celular útil para estudiar la electrofisiología cardiaca y el mecanismo subyacente de las arritmias. 4,6-8 HL-1 células son una línea de cultivo de miocitos fibrilación bien caracterizado. Células HL-1 también mantienen un genotipo y el fenotipo diferenciado de forma única que incluye morfológica, electrofisiológico, y las características farmacológicas de los miocitos auriculares adultos. Estas células expresan genes y proteínas cardíacas, incluyendo important canales iónicos cardíacos (es decir, L y los canales de calcio tipo T) 9 y isoformas maduras de las proteínas contráctiles del sarcómero se encuentran normalmente en miocitos auriculares adultos como los demás y nos han informado anteriormente. 10-13 Además, las células HL-1 pueden ser cultivan para formar un 2-dimensional (2-D) monocapa de miocitos. Por lo tanto, las ventajas de utilizar cultivadas monocapas HL-1 incluyen: 1) el costo relativamente más bajo y más fácil de mantener una línea de cultivo de los miocitos de aislamiento y cultivo de miocitos neonatales primarios; 2) una monocapa confluente de células reduce las complejidades estructurales que resultan de la estructura 3-D del corazón; 3) una monocapa celular se puede eliminar la interferencia de la fibrosis intersticial que se produce en el corazón intacto. Esto se puede utilizar para diseccionar funciones electrofisiológicas específicas de un grupo de miocitos sin interferencia de los fibroblastos y la matriz intersticial; 4) evaluación de las consecuencias funcionales de la manipulación farmacológica o genética en culmonocapas de células radas se pueden lograr con eficacia. Por lo tanto, las células HL-1 se han convertido en un modelo celular ampliamente utilizado para el estudio de diversos aspectos de la fisiología de los miocitos, así como actividades eléctricas anormales inducidos por estimulación. 13-16 Sin embargo, se requiere un manejo y cuidado especial a la cultura monocapas de células sanas que responden al exterior estimulación eléctrica para los estudios de mapeo óptico. Además, la doble procedimiento de tinción de colorante fluorescente puede dañar fácilmente la integridad de las monocapas de células confluentes cultivadas. Por lo tanto, la realización de V m / CA mapeo óptico de doble canal en cultivos de HL-1 monocapas ha sido un gran reto.
El objetivo de este método es proporcionar los pasos clave para llevar a cabo con éxito mapeo óptico de doble canal en cultivos de HL-1 monocapas. Aquí hemos proporcionado amplios detalles sobre un protocolo optimizado para la preparación monocapa-1 HL celular, mapeo óptico de doble canal de una monocapa de células cultivadas, y procesamiento de datos de mapas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artículo describe los aspectos clave de mapeo óptico en una culta HL-1 miocitos auricular monocapa teñido con calcio y tensión tintes fluorescentes sensibles. Incluye el cultivo de una óptima HL-1 monocapa celular, la configuración de los equipos de la cartografía, la cartografía de una monocapa cultivadas, y el análisis de datos.
Para asignar con éxito células cultivadas, la clave es preparar una monocapa de células uniformemente distribuida. Cuando la siembra de las célul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias al doctor Claycomb para proporcionar células HL-1 y el protocolo detallado de mantenimiento. También nos gustaría dar las gracias a la señora Elena Carrillo y el Dr. Seth Robia por su ayuda en la generación de la película de células y el Sr. Pete Caron por su ayuda con la fabricación de algunos accesorios para nuestro sistema de mapeo óptico de doble canal.
Este trabajo fue apoyado por la American Heart Association (10GRNT3770030 y 12GRNT12050478 a XA), los Institutos Nacionales de Salud (HL113640 a XA), y el Fondo de la Universidad Loyola de Investigaciones para el Desarrollo (a XA).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Rhod2 dry powder | AAT Bioquest | 21062 | |
| pluronic | AAT Bioquest | 20050 | |
| DMSO | sigma | 276855 | |
| Rh237 | Invitrogen | S-1109 | |
| NaCl | sigma | S7653 | |
| KCl | sigma | P3911 | |
| KH2PO4 | sigma | P0662 | |
| NaH2PO4 | sigma | S9638 | |
| MgSO4 | sigma | M7506 | |
| D-Glucose | sigma | G8270 | |
| NaHCO3 | sigma | S6014 | |
| CaCl2 | sigma | C3881 | |
| HEPEs | sigma | H3375 |
References
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).
- Salama, G., Hwang, S. M., et al. Simultaneous optical mapping of intracellular free calcium and action potentials from Langendorff perfused hearts. Current protocols in cytometry / editorial board, J. Paul Robinson, managing editor … [et al.]. 12 (Unit 12 17), (2009).
- Laurita, K. R., Singal, A. Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 280 (5), H2053-H2060 (2001).
- Fast, V. G. Simultaneous optical imaging of membrane potential and intracellular calcium. J Electrocardiol. 38 (4 Suppl), 107-112 (2005).
- Sowell, B., Fast, V. G. Ionic mechanism of shock-induced arrhythmias: role of intracellular calcium. Heart Rhythm. 9 (1), 96-104 (2012).
- Fast, V. G., Kleber, A. G. Microscopic conduction in cultured strands of neonatal rat heart cells measured with voltage-sensitive dyes. Circ Res. 73 (5), 914-925 (1993).
- Hou, L., et al. A major role for HERG in determining frequency of reentry in neonatal rat ventricular myocyte monolayer. Circ Res. 107 (12), 1503-1511 (2010).
- Beauchamp, P., et al. Relative contributions of connexins 40 and 43 to atrial impulse propagation in synthetic strands of neonatal and fetal murine cardiomyocytes. Circ Res. 99 (11), 1216-1224 (2006).
- Xia, M., et al. Functional expression of L- and T-type Ca2+ channels in murine HL-1 cells. J Mol Cell Cardiol. 36 (1), 111-119 (2004).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (6), 2979-2984 (1998).
- Fahrenbach, J. P., Ai, X., Banach, K. Decreased intercellular coupling improves the function of cardiac pacemakers derived from mouse embryonic stem cells. J Mol Cell Cardiol. 45 (5), 642-649 (2008).
- Yan, J., et al. c-Jun N-terminal kinase activation contributes to reduced connexin43 and development of atrial arrhythmias. Cardiovasc Res. 97 (3), 589-597 (2013).
- White, S. M., Constantin, P. E., Claycomb, W. C. Cardiac physiology at the cellular level: use of cultured HL-1 cardiomyocytes for studies of cardiac muscle cell structure and function. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), H823-H829 (2004).
- Yang, Z., Shen, W., Rottman, J. N., Wikswo, J. P., Murray, K. T. Rapid stimulation causes electrical remodeling in cultured atrial myocytes. J Mol Cell Cardiol. 38 (2), 299-308 (2005).
- Brundel, B. J., Kampinga, H. H., Henning, R. H. Calpain inhibition prevents pacing-induced cellular remodeling in a HL-1 myocyte model for atrial fibrillation. Cardiovasc Res. 62 (3), 521-528 (2004).
- Umapathy, K., et al. Electrogram fractionation in murine HL-1 atrial monolayer model. Heart Rhythm. 5 (7), 1029-1035 (2008).
- Fast, V. G., Cheek, E. R. Optical mapping of arrhythmias induced by strong electrical shocks in myocyte cultures. Circ Res. 90 (6), 664-670 (2002).
- Bayly, P. V., et al. Estimation of conduction velocity vector fields from epicardial mapping data. IEEE Trans Biomed Eng. 45 (5), 563-571 (1998).
