배양 된 HL-1 심방 근육 세포 단층의 전압 및 칼슘 듀얼 채널 광학 매핑
Summary
This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.
Abstract
광학 매핑은 하트 생체 EX 모두 그대로에 배양 심근 세포 단층에서 심장의 전기 활동을 검출하는 유용한 기술로 입증되었다. HL-1 세포는 심장 생리학 널리 다양한 양상을 연구하기위한 2 차원 모델 세포로서 사용되어왔다. 그러나, 배양 HL-1 심방 세포 단층의 한 시야에서 동시에 광학적지도 칼슘 (Ca) 과도 및 활동 전위에 큰 도전이었다. 특별한 처리 및 관리에 전기적 및 광학적 캡처 매핑 될 수 건강한 세포를 준비 할 필요가 있기 때문이다. 따라서, 우리는 듀얼 채널 광학 매핑을위한 최적의 작업 프로토콜을 개발했습니다. 이 논문에서는 듀얼 채널 광 매핑 실험을 수행하는 방법을 상세히 설명 하였다. 이 프로토콜은 부정맥 개발 활동 전위의 전파 및 CA 역학의 이해를 향상시키는 유용한 도구이다.
Introduction
고유 칼슘 (Ca) 및 전압 (V의 m) 듀얼 채널 광학 매핑 기술 1-5 동시에 그대로 마음과 배양 세포 단일 층에 모두 V의 m과 칼슘 신호를 기록 할 수있는 효율적인 도구로 부상하고있다. 이 기술은 가능한 더 부정맥의 전기 생리 기본 메커니즘을 이해하기 위해 칼슘 과도 활동 전위와의 관계에 관한 강력한 정보를 얻을 수있다.
배양 세포 단일 층은 심장 전기 생리학 및 부정맥의 기본 메커니즘을 연구하는 유용한 셀룰러 모델로 입증했다. 4,6-8 HL-1 세포가 잘 특성화 심방 근육 세포 배양 라인입니다. HL-1 세포는 형태 학적, 전기 생리 및 성인 심방 근육 세포의 약리학 적 특성을 포함하는 차별화 된 유전자형과 표현형을 유지한다. 이 세포들은 importa을 포함한 심장 유전자와 단백질을 표현NT 심장 이온 채널 (즉, L- 및 T 형 칼슘 채널) 9 sarcomeric 수축성 단백질의 성숙 이성체가 정상적으로 등의 성인 심방 근육 세포에서 발견 우리는 이전에보고했다. (10-13) 또한, HL-1 세포가 될 수 2 차원 (2-D) 심근 세포의 단층을 형성하기 위해 배양 하였다. 따라서, 배양 된 HL-1 단층을 사용할 때의 장점은 1) 상대적으로 낮은 비용과 더 쉽게 분리 및 일차 배양 신생아 심근 세포보다 심근 세포 배양 라인을 유지하기; 2) 세포가 단층은 심장의 3-D 구조로 인한 구조의 복잡성을 감소시킨다; 3) 세포 단층은 그대로 심장에서 발생하는 간질 섬유화의 간섭을 제거 할 수 있습니다. 이것은 간질 섬유 아세포 행렬의 간섭없이 근세포의 특정 그룹의 전기 생리 학적 기능을 절개하는데 사용될 수있다; 막 다른 골목에서 약리학 또는 유전자 조작에서 기능적 결과 4) 평가여 체계적인 세포 단층을 효과적으로 달성 할 수있다. 따라서, HL-1 세포는 심근 세포 생리학의 다양한 측면뿐만 아니라 페이싱에 의한 비정상적인 전기적 활동을 연구하는데 널리 사용되는 셀룰러 모델이되고있다. 외부에 응답 13-16 그러나, 특별한 취급 및 관리 문화에 필요한 건강한 세포 단일 층 광학 매핑 연구를위한 전기 서성 거려. 또한, 이중 형광 염료 염색 과정은 쉽게 세포 배양 합류 단층의 무결성을 손상시킬 수있다. 따라서, 배양 HL-1 단일 층에서 수행 V의 m / CA 듀얼 채널 광학 매핑은 큰 도전이었다.
이 방법의 목적은 성공적으로 배양 HL-1 단층 듀얼 채널 광 맵핑을 수행하기위한 주요 단계를 제공하는 것이다. 여기에서 우리는 HL-1 세포 단층 준비, 배양 세포 단층의 듀얼 채널 광학 매핑 및 매핑 데이터 처리에 최적화 된 프로토콜에 대한 광범위한 정보를 제공하고 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 문서에서는 칼슘 및 전압에 민감한 형광 염료로 염색 배양 HL-1 심방의 심근 세포 단일 층에 광학 매핑의 주요 측면에 대해 설명합니다. 또한, 최적의 HL-1 세포 단층, 매핑 장치의 설정을 배양하는 배양 된 단층을 매핑 및 데이터 분석을 포함한다.
성공적으로 배양 된 세포를 매핑, 키는 균일하게 분포 된 세포 단층을 제조하는 공정이다. 커버 슬립에의 세포를 파종 할 때, 균…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 HL-1 세포 및 세부 유지 보수 프로토콜을 제공하기 위해 박사 Claycomb에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 우리의 듀얼 채널 광학 매핑 시스템에 대한 몇 가지 액세서리를 만드는 그의 도움을 셀 영화 씨와 피트 카론를 생성하는 그들의 도움 씨 엘레나 카리 박사 세스 Robia에게 감사의 말씀을 전합니다.
이 작품은 (XA에 10GRNT3770030 & 12GRNT12050478) 미국 심장 협회 (American Heart Association), 국립 보건원 (XA에 HL113640) 및 (XA에) 로욜라 대학 연구 개발 기금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Rhod2 dry powder | AAT Bioquest | 21062 | |
| pluronic | AAT Bioquest | 20050 | |
| DMSO | sigma | 276855 | |
| Rh237 | Invitrogen | S-1109 | |
| NaCl | sigma | S7653 | |
| KCl | sigma | P3911 | |
| KH2PO4 | sigma | P0662 | |
| NaH2PO4 | sigma | S9638 | |
| MgSO4 | sigma | M7506 | |
| D-Glucose | sigma | G8270 | |
| NaHCO3 | sigma | S6014 | |
| CaCl2 | sigma | C3881 | |
| HEPEs | sigma | H3375 |
References
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).
- Salama, G., Hwang, S. M., et al. Simultaneous optical mapping of intracellular free calcium and action potentials from Langendorff perfused hearts. Current protocols in cytometry / editorial board, J. Paul Robinson, managing editor … [et al.]. 12 (Unit 12 17), (2009).
- Laurita, K. R., Singal, A. Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 280 (5), H2053-H2060 (2001).
- Fast, V. G. Simultaneous optical imaging of membrane potential and intracellular calcium. J Electrocardiol. 38 (4 Suppl), 107-112 (2005).
- Sowell, B., Fast, V. G. Ionic mechanism of shock-induced arrhythmias: role of intracellular calcium. Heart Rhythm. 9 (1), 96-104 (2012).
- Fast, V. G., Kleber, A. G. Microscopic conduction in cultured strands of neonatal rat heart cells measured with voltage-sensitive dyes. Circ Res. 73 (5), 914-925 (1993).
- Hou, L., et al. A major role for HERG in determining frequency of reentry in neonatal rat ventricular myocyte monolayer. Circ Res. 107 (12), 1503-1511 (2010).
- Beauchamp, P., et al. Relative contributions of connexins 40 and 43 to atrial impulse propagation in synthetic strands of neonatal and fetal murine cardiomyocytes. Circ Res. 99 (11), 1216-1224 (2006).
- Xia, M., et al. Functional expression of L- and T-type Ca2+ channels in murine HL-1 cells. J Mol Cell Cardiol. 36 (1), 111-119 (2004).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (6), 2979-2984 (1998).
- Fahrenbach, J. P., Ai, X., Banach, K. Decreased intercellular coupling improves the function of cardiac pacemakers derived from mouse embryonic stem cells. J Mol Cell Cardiol. 45 (5), 642-649 (2008).
- Yan, J., et al. c-Jun N-terminal kinase activation contributes to reduced connexin43 and development of atrial arrhythmias. Cardiovasc Res. 97 (3), 589-597 (2013).
- White, S. M., Constantin, P. E., Claycomb, W. C. Cardiac physiology at the cellular level: use of cultured HL-1 cardiomyocytes for studies of cardiac muscle cell structure and function. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), H823-H829 (2004).
- Yang, Z., Shen, W., Rottman, J. N., Wikswo, J. P., Murray, K. T. Rapid stimulation causes electrical remodeling in cultured atrial myocytes. J Mol Cell Cardiol. 38 (2), 299-308 (2005).
- Brundel, B. J., Kampinga, H. H., Henning, R. H. Calpain inhibition prevents pacing-induced cellular remodeling in a HL-1 myocyte model for atrial fibrillation. Cardiovasc Res. 62 (3), 521-528 (2004).
- Umapathy, K., et al. Electrogram fractionation in murine HL-1 atrial monolayer model. Heart Rhythm. 5 (7), 1029-1035 (2008).
- Fast, V. G., Cheek, E. R. Optical mapping of arrhythmias induced by strong electrical shocks in myocyte cultures. Circ Res. 90 (6), 664-670 (2002).
- Bayly, P. V., et al. Estimation of conduction velocity vector fields from epicardial mapping data. IEEE Trans Biomed Eng. 45 (5), 563-571 (1998).
