Spenning og Kalsium Dual Channel Optisk Kartlegging av Cultured HL-en atrial myocyte med ett lag
Summary
This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.
Abstract
Optisk kartlegging har vist seg å være en verdifull teknikk for å oppdage hjerte elektrisk aktivitet på både intakt ex vivo hjerter og i dyrkede myocyte monolagene. HL-1 celler har blitt mye brukt som en to-dimensjonal cellulære modell for å studere ulike aspekter av hjerte fysiologi. Men det har vært en stor utfordring for optisk kartet kalsium (Ca) transienter og aksjonspotensialer samtidig fra samme synsfelt i en kultivert HL-en atrial cellemonolag. Dette er fordi spesiell håndtering og omsorg er nødvendig for å forberede sunne celler som kan være elektrisk fanget og optisk kartlagt. Derfor har vi utviklet en optimal arbeidsprotokoll for dual channel optisk kartlegging. I dette manuskriptet, har vi beskrevet i detalj hvordan du utfører dual channel optisk kartlegging eksperiment. Denne protokollen er et nyttig verktøy for å øke forståelsen av aksjonspotensialet forplantning og Ca kinetikk i arytmi utvikling.
Introduction
En unik kalsium (Ca) og spenning (V m) dual channel optisk kartlegging teknikk 1-5 fremstår som et effektivt verktøy for å samtidig registrere V m og Ca signaler i både intakt hjerter og kultiverte cellemonolag. Denne teknikken gjør det mulig å få verdifull informasjon om forholdet mellom kalsium transienter og aksjonspotensialer for bedre å forstå de underliggende elektrofysiologiske mekanismer for hjertearytmier.
Dyrkede cellemonolagene har vist seg å være en nyttig cellulær modell for å studere hjertets elektrofysiologi og den underliggende mekanisme for arytmier. 4,6-8 HL-1-celler er en godt karakterisert atrial myocyte kultur linje. HL-1 celler også opprettholde et unikt differensiert genotype og fenotype som inkluderer morfologiske, elektrofysiologiske og farmakologiske egenskapene til voksne atrial myocytes. Disse celler uttrykker hjerte gener og proteiner, inkludert important hjerte ionekanaler (dvs. L- og T-type kalsiumkanaler) 9 og modne isoformer av sarcomeric kontraktile proteiner som normalt finnes hos voksne atrielle myocytter som andre, og vi har tidligere rapportert. 10 til 13 I tillegg kan HL-1-celler bli dyrket for å danne en to-dimensjonal (2-D) myocyte monolag. Således er fordelene ved å anvende dyrkede HL-1 monolag omfatter: 1) relativt lavere pris og enklere å vedlikeholde en myocyte kultur linje enn isolering og dyrking av primære neonatale myocytter; 2) et sammenflytende monolag av celler reduserer de strukturelle kompleksitet som resulterer fra 3-D struktur av hjertet; 3) en celle monolag kan eliminere forstyrrelser av interstitiell fibrose som oppstår i det intakte hjertet. Dette kan brukes til å dissekere spesifikke elektrofysiologiske funksjoner av en gruppe av myocytter uten innblanding av fibroblaster og interstitial matrise; 4) vurdering av funksjonelle konsekvenser fra farmakologisk eller genetisk manipulasjon i Culstilles cellemonolagene kan effektivt oppnås. Derfor har HL-1 celler blir en mye brukt mobilnettet modell for å studere ulike aspekter av myocyte fysiologi samt pace-indusert unormale elektriske aktiviteter. 13-16 er imidlertid spesiell håndtering og omsorg som kreves for å kultur sunne cellemonolag som reagerer på ytre elektrisk pacing for optiske kartleggingsstudier. I tillegg kan to fluorescerende fargestoff fargeprosedyre lett skade integriteten av dyrkede sammenflytende cellemonolag. Dermed har du utfører V m / CA tokanals optisk kartlegging i dyrkede HL-1 monolagene vært en stor utfordring.
Målet med denne metoden er å gi de viktigste trinnene for vellykket gjennomføring tokanals optisk kartlegging i dyrkede HL-1 monolagene. Her har vi gitt omfattende detaljer om en optimalisert protokoll for HL-en cellemonolag forberedelse, dual channel optisk kartlegging av en kultivert cellemonolag, og kartlegging databehandling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne artikkelen beskriver de viktigste aspektene ved optisk kartlegging i en kultivert HL-en atrial myocyte enkeltlag farget med kalsium og spenning sensitive fluorescerende fargestoffer. Det inkluderer dyrking av en optimal HL-en cellemonolag, oppsett av kartlegging utstyr, kartlegge en kultivert enkeltlag, og dataanalyse.
Å kunne kartlegge dyrkede celler, er nøkkelen til å forberede en jevnt fordelt cellemonolag. Når seeding cellene på å glassene, sørg for å jevnt spre cellene. Ka…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi ønsker å takke Dr. Claycomb for å gi HL-1 celler og detaljert vedlikeholdsprotokoll. Vi vil også gjerne takke Ms Elena Carrillo og Dr. Seth Robia for deres hjelp med å generere celle film og Mr. Pete Caron for hans hjelp med å gjøre noe tilbehør for vår dual channel optisk kartsystem.
Dette arbeidet ble støttet av American Heart Association (10GRNT3770030 & 12GRNT12050478 til XA), National Institutes of Health (HL113640 til XA), og Loyola University Research Development Fund (til XA).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Rhod2 dry powder | AAT Bioquest | 21062 | |
| pluronic | AAT Bioquest | 20050 | |
| DMSO | sigma | 276855 | |
| Rh237 | Invitrogen | S-1109 | |
| NaCl | sigma | S7653 | |
| KCl | sigma | P3911 | |
| KH2PO4 | sigma | P0662 | |
| NaH2PO4 | sigma | S9638 | |
| MgSO4 | sigma | M7506 | |
| D-Glucose | sigma | G8270 | |
| NaHCO3 | sigma | S6014 | |
| CaCl2 | sigma | C3881 | |
| HEPEs | sigma | H3375 |
References
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).
- Salama, G., Hwang, S. M., et al. Simultaneous optical mapping of intracellular free calcium and action potentials from Langendorff perfused hearts. Current protocols in cytometry / editorial board, J. Paul Robinson, managing editor … [et al.]. 12 (Unit 12 17), (2009).
- Laurita, K. R., Singal, A. Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 280 (5), H2053-H2060 (2001).
- Fast, V. G. Simultaneous optical imaging of membrane potential and intracellular calcium. J Electrocardiol. 38 (4 Suppl), 107-112 (2005).
- Sowell, B., Fast, V. G. Ionic mechanism of shock-induced arrhythmias: role of intracellular calcium. Heart Rhythm. 9 (1), 96-104 (2012).
- Fast, V. G., Kleber, A. G. Microscopic conduction in cultured strands of neonatal rat heart cells measured with voltage-sensitive dyes. Circ Res. 73 (5), 914-925 (1993).
- Hou, L., et al. A major role for HERG in determining frequency of reentry in neonatal rat ventricular myocyte monolayer. Circ Res. 107 (12), 1503-1511 (2010).
- Beauchamp, P., et al. Relative contributions of connexins 40 and 43 to atrial impulse propagation in synthetic strands of neonatal and fetal murine cardiomyocytes. Circ Res. 99 (11), 1216-1224 (2006).
- Xia, M., et al. Functional expression of L- and T-type Ca2+ channels in murine HL-1 cells. J Mol Cell Cardiol. 36 (1), 111-119 (2004).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (6), 2979-2984 (1998).
- Fahrenbach, J. P., Ai, X., Banach, K. Decreased intercellular coupling improves the function of cardiac pacemakers derived from mouse embryonic stem cells. J Mol Cell Cardiol. 45 (5), 642-649 (2008).
- Yan, J., et al. c-Jun N-terminal kinase activation contributes to reduced connexin43 and development of atrial arrhythmias. Cardiovasc Res. 97 (3), 589-597 (2013).
- White, S. M., Constantin, P. E., Claycomb, W. C. Cardiac physiology at the cellular level: use of cultured HL-1 cardiomyocytes for studies of cardiac muscle cell structure and function. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), H823-H829 (2004).
- Yang, Z., Shen, W., Rottman, J. N., Wikswo, J. P., Murray, K. T. Rapid stimulation causes electrical remodeling in cultured atrial myocytes. J Mol Cell Cardiol. 38 (2), 299-308 (2005).
- Brundel, B. J., Kampinga, H. H., Henning, R. H. Calpain inhibition prevents pacing-induced cellular remodeling in a HL-1 myocyte model for atrial fibrillation. Cardiovasc Res. 62 (3), 521-528 (2004).
- Umapathy, K., et al. Electrogram fractionation in murine HL-1 atrial monolayer model. Heart Rhythm. 5 (7), 1029-1035 (2008).
- Fast, V. G., Cheek, E. R. Optical mapping of arrhythmias induced by strong electrical shocks in myocyte cultures. Circ Res. 90 (6), 664-670 (2002).
- Bayly, P. V., et al. Estimation of conduction velocity vector fields from epicardial mapping data. IEEE Trans Biomed Eng. 45 (5), 563-571 (1998).
