تحليل وضع الأسنان جرثومة تعصيب استخدام أجهزة ميكروفلويديك المشارك الثقافة
Summary
Co-cultures represent a valuable method to study the interactions between nerves and target tissues and organs. Microfluidic systems allow co-culturing ganglia and whole developing organs or tissues in different culture media, thus representing a valuable tool for the in vitro study of the crosstalk between neurons and their targets.
Abstract
تعصيب يلعب دورا رئيسيا في تطوير والتوازن وتجديد الأعضاء والأنسجة. ومع ذلك، فإن الآليات الكامنة وراء هذه الظواهر ليست مفهومة جيدا حتى الآن. على وجه الخصوص، وإهمال دور تعصيب في نمو الأسنان والتجدد.
قدمت عدة الدراسات المجراة على معلومات هامة حول أنماط تعصيب من أنسجة الأسنان خلال عمليات التنمية وإصلاح مختلف النماذج الحيوانية. ومع ذلك، فإن معظم هذه الأساليب ليست الأمثل لتسليط الضوء على الأساس الجزيئي للتفاعلات بين الألياف العصبية والأجهزة المستهدفة والأنسجة.
المشترك الثقافات تشكل وسيلة قيمة للتحقيق والتعامل مع التفاعلات بين الألياف العصبية والأسنان في بيئة تسيطر عليها والمعزولة. في العقود الأخيرة، وقد أجريت التقليدية المشترك الثقافات باستخدام نفس مستنبت لفترات قصيرة جدا (على سبيل المثال، يومين)للتحقيق في الآثار جذابة أو مثيرة للاشمئزاز لتطوير أنسجة الفم والأسنان على الألياف العصبية الحسية. ومع ذلك، لا بد من تمديد فترة ثقافة للتحقيق في آثار تعصيب على التشكل الأسنان وتمايز خلوي.
نظم على microfluidics تسمح المشترك الثقافات من الخلايا العصبية وأنواع مختلفة من الخلايا في وسائل الإعلام ثقافة المناسب لها. لقد أثبتنا في الآونة الأخيرة أن العقد الثلاثي التوائم (TG) والأسنان قادرين على البقاء على قيد الحياة لفترة طويلة من الزمن عندما شارك في تربيتها في أجهزة ميكروفلويديك، وأنها تحافظ في هذه الظروف نمط تعصيب نفسه أنها تظهر في الجسم الحي.
على هذا الأساس، نحن تصف كيفية عزل ويصف التعاون ثقافة تطوير مثلث التوائم العقد والأسنان الجراثيم في البروتوكول ميكروفلويديك شارك في الثقافة system.This وسيلة بسيطة ومرنة للمشاركة في ثقافة العقد / الأعصاب والأنسجة المستهدفة ودراسة الأدوار من جزيئات محددة بشأن هذه التفاعلات في مقاولاتolled وبيئة معزولة.
Introduction
تعصيب يلعب دورا رئيسيا في تطوير والتوازن وتجديد الأعضاء والأنسجة 1،2. وعلاوة على ذلك، تشارك تعصيب في تنظيم تكاثر الخلايا الجذعية، وتعبئة والتمايز 3-5. في الواقع، أظهرت الدراسات الأخيرة التي تحققت في أنسجة مجمع فموي وجهي أن الأعصاب الحركية ضرورية لالظهارية وظيفة الخلايا الاصلية خلال تطوير وتجديد اللعابية الغدد 6،7. وبالمثل، فقد ثبت أن تعصيب ضروري لتطوير وصيانة براعم الذوق 8-11. وبالتالي، فمن المهم تحليل الأدوار إلا أنها مهملة من تعصيب في تطوير أجهزة فموي وجهي الهامة الأخرى والأنسجة مثل الأسنان.
على الرغم من تعصيب غنية من أسنان الكبار، وعلى النقيض من جميع الأعضاء والأنسجة الأخرى في الجسم، develoالأسنان بينغ تبدأ في أن معصب في المراحل الأولى بعد الولادة. تنشأ الأسنان نتيجة للتفاعلات متسلسلة ومتبادلة بين الأديم الظاهر عن طريق الفم والجمجمة العصبية المشتقة من قمة اللحمة المتوسطة. هذه التفاعلات تؤدي إلى خلايا تكوين المينا المستمدة الظهارية والخلايا المولدة للعاج المستمدة من اللحمة المتوسطة التي هي المسؤولة عن تشكيل المينا وعاج الأسنان، على التوالي 12. الأعصاب الحسية من العقد مثلث التوائم والأعصاب متعاطفة من العقد عنق الرحم متفوقة يعصب أسنان البالغين 13-15. خلال مرحلة التطور الجنيني، الألياف العصبية المنبثقة عن مشروع العقد الثلاثي التوائم نحو جراثيم الأسنان النامية وتدريجيا تحيط بهم ولكنها لا تخترق حليمة اللحمة المتوسطة طب الأسنان (13). الألياف العصبية تدخل اللب اللحمة المتوسطة الأسنان في مراحل نمو أكثر تقدما التي ترتبط مع التمايز مصورات العاج وعاج مصفوفة ترسب 16. لب الأسنان تعصيب هو COMPLeted قريبا بعد بزوغ الأسنان في تجويف الفم (13). وقد كشفت الدراسات السابقة بأن مختلف semaphorins وneurotrophins يشاركون في تنظيم تعصيب أثناء تكون السن 16-19. وقد أثبتت دراسات سابقة بوضوح أن تعصيب هو شرط أساسي لتكوين الأسنان في الأسماك 20. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن توازن الخلايا الجذعية اللحمة المتوسطة الأسنان في القواطع الماوس ينظمه الأعصاب الحسية عن طريق إفراز القنفذ سونيك (SHH) 21. ومع ذلك، فإن دور تعصيب في السن بدء وتطوير وتجديد لا يزال مثيرا للجدل في الثدييات 22-24.
وقد قدم عدد كبير من الدراسات المجراة على معلومات هامة حول أنماط تعصيب من أنسجة الأسنان خلال عمليات التنمية وإصلاح مختلف النماذج الحيوانية 13،25،26. ومع ذلك، فإن معظم هذه APPROأوجاع ليست الأمثل لتسليط الضوء على الأساس الجزيئي للتفاعلات بين الألياف العصبية والأجهزة المستهدفة والأنسجة. المشترك الثقافات تشكل وسيلة قيمة للتحقيق والتعامل مع التفاعلات بين الألياف العصبية والأسنان في بيئة تسيطر عليها والمعزولة 26-29. في الوقت نفسه، وشارك في زراعة تخضع لتعديلات فنية مختلفة. على سبيل المثال، الأعصاب والأنسجة الأسنان محددة (على سبيل المثال، لب الأسنان، جريب الأسنان، طب الأسنان ظهارة) غالبا ما تتطلب ثقافة وسائل الإعلام المختلفة من أجل ضمان بقاء الأنسجة لفترات طويلة من الزمن 30-32.
في العقود الأخيرة، وقد أجريت التقليدية المشترك الثقافات باستخدام نفس مستنبت لفترات قصيرة جدا (على سبيل المثال، يومين) للتحقيق في الآثار جذابة أو مثيرة للاشمئزاز لتطوير أنسجة الفم والأسنان على الألياف العصبية الحسية 27-29.ومع ذلك، لا بد من تمديد فترة ثقافة للتحقيق في آثار تعصيب على التشكل الأسنان وتمايز خلوي، ودراسة ديناميات الألياف العصبية المتفرعة داخل الأجهزة المستهدفة. ولذلك، فإن غير متجاورة المشترك الثقافات يكون أكثر ملاءمة لإجراء دراسات على الخلايا العصبية الأسنان الأنسجة التفاعلات.
نظم على microfluidics تسمح المشترك الثقافات من الخلايا العصبية وأنواع مختلفة من الخلايا في وسائل الإعلام ثقافة المناسب لها. في هذه الأجهزة، يتم فصل الأنسجة الأسنان والخلايا العصبية في أماكن مختلفة، بينما يسمح للنمو من المحاور من أجسام الخلايا العصبية من خلال microchannels نحو مقصورة تحتوي على الأنسجة المستهدفة 33. تم الأجهزة ميكروفلويديك تستخدم بالفعل لدراسة التفاعلات بين الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الصغيرة 34،35، فضلا عن الخلية إلى التفاعلات الخلية في سرطان واتساع الأوعية الدموية 35. وعلاوة على ذلك، وقد استخدمت هذه الأنظمة لدراسة التفاعلات بين DORSآل العقد الجذرية وبانيات 36.
لقد أثبتنا في الآونة الأخيرة أن العقد الثلاثي التوائم (TG) والأسنان قادرين على البقاء على قيد الحياة لفترات طويلة من الزمن عندما شارك في تربيتها في أجهزة ميكروفلويديك 37. وعلاوة على ذلك، لقد أثبتنا أن الأسنان من مراحل تنموية مختلفة الحفاظ في هذه الظروف في المختبر نفس الآثار مثير للاشمئزاز أو جذابة على تعصيب مثلث التوائم أنها تظهر في الجسم الحي 37. وينص هذا البروتوكول على معلومات حول طريقة بسيطة وقوية ومرنة للمشاركة في ثقافة العقد / الأعصاب والأنسجة المستهدفة ودراسة دور جزيئات محددة بشأن هذه التفاعلات في بيئة تسيطر عليها والمعزولة.
Protocol
Representative Results
Discussion
سابقة في الدراسات المختبرية من تعصيب الأسنان استندت شارك الثقافات التقليدية من العقد مثلث التوائم وأنسجة الأسنان أو خلايا 26،28،29. وأجريت هذه الدراسات للتحقيق أساسا الآثار جذابة من هذه الخلايا أو الأنسجة على محاور الحسية 38. على الرغم من تحقيق تق?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was funded by the University of Zurich. The authors would like to thank Estrela Neto and Dr. Meriem Lamghari for helping in establishing the co-culture conditions.
Materials
| AXIS Axon Isolation Devices | Millipore | AX15010-TC | Microchannels of different lenght are available |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| B27 | Gibco | 17504 | |
| Recombinant Mouse beta-NGF | R&D Systems | 1156-NG-100 | Human and Rat beta-NGF (R&D Systems) are equivalent |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320-033 |
References
- Pagella, P., Jiménez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 71, 2241-2251 (2014).
- Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends in neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).
- Brownell, I., Guevara, E., Bai, C. B., Loomis, C. A., Joyner, A. L. Nerve-derived sonic hedgehog defines a niche for hair follicle stem cells capable of becoming epidermal stem cells. Cell stem cell. 8 (5), 552-565 (2011).
- Katayama, Y., Battista, M., et al. Signals from the sympathetic nervous system regulate hematopoietic stem cell egress from bone marrow. Cell. 124 (2), 407-421 (2006).
- Fitch, S. R., Kimber, G. M., et al. Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis. Cell stem cell. 11 (4), 554-566 (2012).
- Knox, S. M., Lombaert, I. M. a., Reed, X., Vitale-Cross, L., Gutkind, J. S., Hoffman, M. P. Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. Science(New York, N.Y.). 329 (5999), 1645-1647 (2010).
- Knox, S. M., Lombaert, I. M. A., et al. Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration. Nature communications. 4, 1494 (2013).
- Oakley, B., Witt, M. Building sensory receptors on the tongue. Journal of neurocytology. 33 (6), 631-646 (2004).
- Oakley, B., Brandemihl, A., Cooper, D., Lau, D., Lawton, A., Zhang, C. The morphogenesis of mouse vallate gustatory epithelium and taste buds requires BDNF-dependent taste neurons. Brain research. Developmental brain research. 105 (1), 85-96 (1998).
- Sun, H., Oakley, B. Development of anterior gustatory epithelia in the palate and tongue requires epidermal growth factor receptor. Developmental biology. 242 (1), 31-43 (2002).
- Mistretta, C. M., Goosens, K. a., Farinas, I., Reichardt, L. F. Alterations in size, number, and morphology of gustatory papillae and taste buds in BDNF null mutant mice demonstrate neural dependence of developing taste organs. The Journal of comparative neurology. 409 (1), 13-24 (1999).
- Mitsiadis, T. a., Graf, D. Cell fate determination during tooth development and regeneration. Birth defects research. Part C, Embryo today reviews. 87 (3), 199-211 (2009).
- Mohamed, S. S., Atkinson, M. E. A histological study of the innervation of developing mouse teeth. Journal of anatomy. 136 (Pt 4), 735-749 (1983).
- Luukko, K. Immunohistochemical localization of nerve fibres during development of embryonic rat molar using peripherin and protein gene product 9.5 antibodies. Archives of oral biology. 42 (3), 189-195 (1997).
- Johnsen, D. Innervation of teeth: qualitative, quantitative, and developmental assessment. Journal of dental research. 64, 555-563 (1985).
- Mitsiadis, T. a., Dicou, E., Joffre, A., Magloire, H. Immunohistochemical localization of nerve growth factor (NGF) and NGF receptor (NGF-R) in the developing first molar tooth of the rat. Differentiation; research in biological diversity. 49 (1), 47-61 (1992).
- Mitsiadis, T. a., Luukko, K. Neurotrophins in odontogenesis. The International journal of developmental biology. 39 (1), 0214-6282 (1995).
- Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation. Differentiation; research in biological diversity. 84 (5), 371-379 (2012).
- Kettunen, P., Løes, S., et al. Coordination of trigeminal axon navigation and patterning with tooth organ formation: epithelial-mesenchymal interactions and epithelial Wnt4 and Tgfbeta1 regulate semaphorin 3a expression in the dental mesenchyme. Development (Cambridge, England). 132 (2), 323-334 (2005).
- Tuisku, F., Hildebrand, C. Evidence for a neural influence on tooth germ generation in a polyphyodont species. Developmental biology. 165, 1-9 (1994).
- Zhao, H., Feng, J., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell stem cell. 14 (2), 160-173 (2014).
- Kettunen, P., Kvinnsland, H., Luukko, K. Mouse rudimentary diastema tooth primordia are devoid of peripheral nerve fibers. Anatomy and embryology. 205 (3), 187-191 (2002).
- Lumsend, A., Buchanan, J. An experimental study of timing and topography of early tooth development in the mouse embryo. Archives of oral biology. , 301-311 (1986).
- Kollar, E., Lumsend, A. Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation. Journal de Biologia Buccale. 7 (1), 49-60 (1979).
- Luukko, K., Kettunen, P. Coordination of tooth morphogenesis and neuronal development through tissue interactions: lessons from mouse models. Experimental cell research. 325 (2), 72-77 (2014).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro. Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).
- Lumsend, A., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323 (9), 538-539 (1986).
- Lillesaar, C., Fried, K. Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage. Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro. Neuroscience letters. 308 (3), 161-164 (2001).
- Petrinovic, M. M., Duncan, C. S., et al. Neuronal Nogo-A regulates neurite fasciculation, branching and extension in the developing nervous system. Development(Cambridge, England). 137 (15), 2539-2550 (2010).
- Otsu, K., Fujiwara, N., Harada, H. Odontogenesis. Methods in Molecular Biology. 887, (2012).
- Mitsiadis, T. a., Drouin, J. Deletion of the Pitx1 genomic locus affects mandibular tooth morphogenesis and expression of the Barx1 and Tbx1 genes. Developmental biology. 313 (2), 887-896 (2008).
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).
- Hosmane, S., Tegenge, M. A., et al. Toll/interleukin-1 receptor domain-containing adapter inducing interferon-β mediates microglial phagocytosis of degenerating axons. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (22), 7745-7757 (2012).
- Delamarche, E., Tonna, N., Lovchik, R. D., Bianco, F., Matteoli, M. Pharmacology on microfluidics: multimodal analysis for studying celll-cell interaction. Current opinion in pharmacology. 13 (5), 821-828 (2013).
- Neto, E., Alves, C. J., et al. Sensory neurons and osteoblasts: close partners in a microfluidic environment. Integrative Biology. , (2014).
- Pagella, P., Neto, E., Jiménez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation. Frontiers in physiology. 5 (August), (2014).
- Connor, R., Tessier-Lavigne, M. Identification of maxillary factor, a maxillary process-derived chemoattractant for developing trigeminal sensory axons. Neuron. 24, 165-178 (1999).
