Análise de Desenvolvimento de dente Germ Innervation Utilizar dispositivos microfluídicos Co-cultura
Summary
Co-cultures represent a valuable method to study the interactions between nerves and target tissues and organs. Microfluidic systems allow co-culturing ganglia and whole developing organs or tissues in different culture media, thus representing a valuable tool for the in vitro study of the crosstalk between neurons and their targets.
Abstract
Inervação desempenha um papel chave no desenvolvimento, homeostase e regeneração de órgãos e tecidos. No entanto, os mecanismos subjacentes a esses fenômenos não são bem compreendidas ainda. Em particular, o papel de inervação no desenvolvimento e regeneração de dente é negligenciado.
Vários estudos in vivo têm fornecido informações importantes sobre os padrões de inervação dos tecidos dentários durante os processos de vários modelos animais de desenvolvimento e reparação. No entanto, a maioria destas abordagens não são ideais para destacar a base molecular das interacções entre as fibras nervosas e os órgãos e tecidos alvo.
Co-culturas constituem um método valioso para estudar e manipular as interacções entre as fibras nervosas e os dentes num ambiente controlado e isolado. Nas últimas décadas, co-culturas convencionais, utilizando o mesmo meio de cultura foram efectuadas por períodos muito curtos (por exemplo, dois dias)investigar os efeitos atractivas ou repulsivas de desenvolvimento de tecidos orais e dentais em fibras nervosas sensoriais. No entanto, a extensão do período de cultura é necessária para investigar os efeitos da inervação sobre a morfogénese do dente e citodiferenciação.
Sistemas microfluidicos permitir co-culturas de neurónios e diferentes tipos de células no seu meio de cultura apropriado. Nós demonstramos recentemente que gânglios trigeminais (TG) e os dentes são capazes de sobreviver durante um longo período de tempo quando co-cultivadas em microcanais, e que eles se mantêm em estas condições o mesmo padrão de inervação que mostram in vivo.
Nesta base, nós descrevemos como isolar e co-cultura em desenvolvimento e dos gânglios trigêmeo germes dentários em um protocolo de co-cultura microfluídicos system.This descreve uma forma simples e flexível para co-cultura gânglios / nervos e tecidos-alvo e para estudar os papéis moléculas de específicas sobre estas interacções em um controlled e ambiente isolado.
Introduction
Inervação desempenha um papel chave no desenvolvimento, homeostase e regeneração de órgãos e tecidos 1,2. Além disso, a inervação está envolvido na regulação da proliferação de células estaminais, diferenciação e mobilização 3-5. Com efeito, estudos recentes realizados em tecidos do complexo orofacial têm mostrado que os nervos parassimpáticos são necessários para a função de células progenitoras epiteliais durante o desenvolvimento e regeneração das glândulas salivares 6,7. Da mesma forma, foi demonstrado que a inervação é necessário para o desenvolvimento e manutenção de paladar 8-11. Assim, é importante analisar as funções ainda negligenciadas de inervação no desenvolvimento de outros órgãos e tecidos orofaciais importantes, tais como os dentes.
Apesar da rica inervação dos dentes adultos, e em contraste com todos os outros órgãos e tecidos do corpo, desendentes de ping começar a ser inervados nas primeiras fases pós-natais. Os dentes se desenvolvem como resultado de interações seqüenciais e recíprocas entre o ectoderma oral e cranial mesênquima derivado da crista neural. Estas interacções dar origem ao derivado ameloblastos-epiteliais e mesenquimais derivadas de odontoblastos que são responsáveis pela formação do esmalte e dentina, respectivamente 12. Nervos sensoriais do gânglio trigeminal e nervos simpáticos do gânglio cervical superior inervam os dentes adulto 13-15. Durante a embriogênese, fibras nervosas que emana do projeto gânglios trigeminal para os germes dentários em desenvolvimento e, progressivamente, cercá-los, mas eles não penetram no mesênquima papila dentária 13. As fibras nervosas entrar no mesênquima polpa dental em estágios mais avançados de desenvolvimento que se correlacionam com diferenciação de odontoblastos e matriz dentinária deposição 16. Inervação polpa dentária é complETED logo após a erupção dos dentes na cavidade oral 13. Estudos anteriores revelaram que vários semaforinas e neurotrofinas estão envolvidos na regulação da inervação durante odontogenesis 16-19. Estudos anteriores demonstraram claramente que a inervação é um pré-requisito para a formação dos dentes em peixes 20. Estudos mais recentes têm mostrado que a homeostase das células-tronco mesenquimais dentária em incisivos de rato é regulada por nervos sensoriais através da secreção de sonic hedgehog (Shh) 21. No entanto, o papel da inervação em dente de iniciação, desenvolvimento e regeneração ainda é altamente controversa em mamíferos 22-24.
Uma infinidade de estudos in vivo têm fornecido informações importantes sobre os padrões de inervação dos tecidos dentários durante os processos de vários modelos animais 13,25,26 desenvolvimento e reparação. No entanto, a maioria destes Approdores não são ideais para destacar a base molecular das interacções entre as fibras nervosas e os órgãos e tecidos alvo. Co-culturas constituem um método valioso para estudar e manipular as interacções entre as fibras nervosas e os dentes num ambiente controlado e isolado 26-29. Ao mesmo tempo, a co-cultura é sujeita a várias adaptações técnicas. Por exemplo, nervos e tecidos dentais específicos (por exemplo, polpa dentária, folículo dental, epitélio dental) muitas vezes requerem diferentes meios de cultura, a fim de garantir a sobrevivência do tecido por longos períodos de tempo de 30-32.
Nas últimas décadas, co-culturas convencionais, utilizando o mesmo meio de cultura foram efectuadas por períodos muito curtos (por exemplo, dois dias) para investigar os efeitos atractivas ou repulsivas de desenvolvimento de tecidos orais e dentais em fibras nervosas sensoriais 27-29.No entanto, a extensão do período de cultura é necessária para investigar os efeitos da inervação na morfogénese e citodiferenciação dente, e para estudar a dinâmica de fibras nervosas de ramificação dentro de órgãos alvo. Portanto, não contíguas co-culturas seria mais apropriada para realizar estudos sobre as interacções de tecidos neuronais-dentário.
Sistemas microfluidicos permitir co-culturas de neurónios e diferentes tipos de células no seu meio de cultura apropriado. Nestes dispositivos, os tecidos dentais e neurónios são separados em diferentes compartimentos, permitindo que o crescimento dos axónios dos corpos celulares neuronais através de microcanais para o compartimento que contém o seu tecido alvo 33. Microcanais têm já sido usadas para estudar as interacções entre neurónios e microglia 34,35, bem como de células para as interacções das células no cancro e neovascularização 35. Além disso, estes sistemas têm sido usados para estudar as interacções entre dorsal gânglios da raiz e osteoblastos 36.
Nós demonstramos recentemente que gânglios trigeminais (TG) e os dentes são capazes de sobreviver durante longos períodos de tempo quando co-cultivadas em microcanais 37. Além disso, demonstrámos que os dentes de diferentes estádios de desenvolvimento em manter estas condições in vitro, os mesmos efeitos repulsivos ou atractivos da inervação do trigémio que mostram in vivo 37. Este protocolo fornece informações sobre uma maneira simples, poderosa e flexível para co-cultura gânglios / nervos e tecidos-alvo e para estudar os papéis de moléculas específicas sobre tais interações em um ambiente controlado e isolado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anterior estudos in vitro de inervação do dente foram baseados em co-culturas convencionais de gânglios do trigémeo e tecidos dentais ou células 26,28,29. Estes estudos foram conduzidos para investigar principalmente os efeitos atraentes dessas células ou tecidos em axônios sensitivos 38. Apesar de trazer avanços significativos no campo, várias questões técnicas foram levantadas. Germes dentários começar a degenerar após alguns dias de cultura 37. Com base nessas o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was funded by the University of Zurich. The authors would like to thank Estrela Neto and Dr. Meriem Lamghari for helping in establishing the co-culture conditions.
Materials
| AXIS Axon Isolation Devices | Millipore | AX15010-TC | Microchannels of different lenght are available |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| B27 | Gibco | 17504 | |
| Recombinant Mouse beta-NGF | R&D Systems | 1156-NG-100 | Human and Rat beta-NGF (R&D Systems) are equivalent |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320-033 |
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