Analyse van de ontwikkelingslanden Tooth Germ Innervatie behulp van microfluïdische co-cultuur apparaten

Summary

Co-cultures represent a valuable method to study the interactions between nerves and target tissues and organs. Microfluidic systems allow co-culturing ganglia and whole developing organs or tissues in different culture media, thus representing a valuable tool for the in vitro study of the crosstalk between neurons and their targets.

Abstract

Innervatie speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling, homeostase en regeneratie van organen en weefsels. Echter, de mechanismen die ten grondslag liggen aan deze fenomenen zijn nog niet goed begrepen. In het bijzonder is de rol van innervatie bij tandontwikkeling en regeneratie verwaarloosd.

Verscheidene in vivo studies hebben belangrijke informatie over de patronen van innervatie van tandheelkundige weefsels die tijdens de ontwikkeling en herstelprocessen van verschillende diermodellen. De meeste van deze benaderingen niet optimaal om de moleculaire basis van de interactie tussen zenuwvezels en target organen en weefsels te benadrukken.

Co-culturen vormen een waardevolle methode te onderzoeken en te manipuleren de interacties tussen zenuwvezels en tanden in een gecontroleerde en geïsoleerde omgeving. In de laatste decennia zijn conventionele co-kweken met hetzelfde kweekmedium uitgevoerd voor zeer korte perioden (bijvoorbeeld twee dagen)naar de aantrekkelijke of afstotende effecten van de ontwikkeling van orale en tandheelkundige weefsels op sensorische zenuwvezels te onderzoeken. Echter, is verlenging van de kweekperiode vereist om de effecten van innervatie voor tanden morfogenese en cytodifferentiation onderzoeken.

Microfluidics systemen maken co-culturen van neuronen en verschillende celtypes in de juiste cultuur media. We hebben onlangs aangetoond dat trigeminale ganglia (TG) en tanden kunnen overleven gedurende langere tijd bij co-gekweekt in microfluïdische inrichtingen, en voeren zij deze omstandigheden dezelfde innervatie patroon dat ze tonen in vivo.

Op basis hiervan beschrijven we hoe te isoleren en co-cultuur ontwikkelt trigeminale ganglia en tandkiemen in een microfluïdische co-cultuur system.This protocol beschrijft een eenvoudige en flexibele manier om co-cultuur ganglia / zenuwen en doelweefsels en de rollen bestuderen specifieke moleculen op dergelijke interacties in een controlled en geïsoleerde omgeving.

Introduction

Innervatie speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling, homeostase en regeneratie van organen en weefsels ^1,2. Bovendien is innervatie betrokken bij de regulatie van stamcel proliferatie, activering en differentiatie ^3-5. Inderdaad, recent studies uitgevoerd in weefsels van het orofaciale complex gebleken dat parasympathische zenuwen noodzakelijk epitheliale stamcellen functie dat bij de ontwikkeling en regeneratie van de speekselklieren ^6,7. Evenzo is aangetoond dat innervatie noodzakelijk is voor de ontwikkeling en instandhouding van smaakpapillen ^8-11. Het is dus belangrijk om de nog verwaarloosde rol van innervatie in de ontwikkeling van andere belangrijke orofaciale organen en weefsels geanalyseerd zoals tanden.

Ondanks de rijke innervatie van volwassen tanden, in tegenstelling tot alle andere organen en weefsels van het lichaam, developing tanden beginnen te worden geïnnerveerd spoedig postnatale fase. Tanden ontstaan ​​als gevolg van sequentiële en wederzijdse interacties tussen de orale ectoderm en craniale neurale kam afgeleide mesenchym. Deze interacties leiden tot epitheliaal afgeleide ameloblasts en mesenchym afgeleide odontoblasten die verantwoordelijk zijn voor de vorming van respectievelijk ¹² glazuur en dentine zijn. Sensorische zenuwen van de nervus ganglia en sympathische zenuwen van de superieure cervicale ganglia innerveren de volwassen tanden ^13-15. Tijdens de embryogenese, zenuwvezels afkomstig van de nervus ganglia project naar de ontwikkeling van tanden kiemen en geleidelijk omringen hen, maar ze niet doordringen in de dentale papilla mesenchym ^13. Zenuwvezels voer de tandheelkundige pulp mesenchyme op meer geavanceerde ontwikkelingsfasen die correleren met odontoblast differentiatie en dentine matrix depositie ^16. Tandmerg innervatie is completed kort na tand uitbarsting in de mondholte ^13. Eerdere studies hebben aangetoond dat verschillende semaforinen en neurotrofinen zijn betrokken bij de regulatie van innervatie in odontogenese ^16-19. Eerdere studies hebben duidelijk aangetoond dat innervatie is een voorwaarde voor tandvorming bij vissen ^20. Recentere studies hebben aangetoond dat de homeostase van dentale mesenchym stamcellen in muizen snijtanden wordt gereguleerd door sensorische zenuwen via secretie van sonic hedgehog (shh) ^21. Toch is de rol van de innervatie in tand initiatie, ontwikkeling en regeneratie is nog steeds zeer omstreden in zoogdieren ^22-24.

Een overvloed van in vivo studies hebben belangrijke informatie over de patronen van innervatie van tandheelkundige weefsels die tijdens de ontwikkeling en herstelprocessen van verschillende diermodellen ^13,25,26. De meeste van deze Appropijn niet optimaal om de moleculaire basis van de interactie tussen zenuwvezels en target organen en weefsels te benadrukken. Co-culturen vormen een waardevolle methode te onderzoeken en te manipuleren de interacties tussen zenuwvezels en tanden in een gecontroleerde en geïsoleerde omgeving ^26-29. Tegelijkertijd, co-kweek wordt onderworpen aan diverse technische aanpassingen. Bijvoorbeeld, zenuwen en specifieke tand (bv tandmerg, tand follikel, tandheelkundige epitheel) vereisen vaak verschillende kweekmedia om weefsel overleving garanderen langere tijd ^30-32.

In de laatste decennia zijn conventionele co-kweken met hetzelfde kweekmedium uitgevoerd voor zeer korte perioden (bijvoorbeeld twee dagen) op de aantrekkelijke of afstotende effecten ontwikkelen orale en dentale weefsels op sensorische zenuwvezels onderzoeken ^{27 – 29.}Echter, is verlenging van de kweekperiode vereist om de effecten van innervatie voor tanden morfogenese en cytodifferentiation onderzoeken en de dynamiek van zenuwvezels vertakking in doelorganen bestuderen. Derhalve zou nietaangrenzende co-kweken geschikter te onderzoeken op neuronale tandweefsel interacties.

Microfluidics systemen maken co-culturen van neuronen en verschillende celtypes in de juiste cultuur media. Bij deze inrichtingen worden tandweefsel en neuronen gescheiden in verschillende compartimenten, terwijl de groei van axons van de neurale cellichamen met microkanalen naar het compartiment met het doelweefsel ^33. Microfluïdische inrichtingen zijn reeds gebruikt om de interactie tussen neuronen en microglia ^34,35, en cel tot cel interacties te bestuderen bij kanker en neovascularisatie ^35. Bovendien zijn deze systemen gebruikt om de interacties tussen dors bestuderenal ganglia en osteoblasten ^36.

We hebben onlangs aangetoond dat trigeminale ganglia (TG) en tanden kunnen overleven gedurende langere tijd bij co-gekweekt in ³⁷ microfluïdische inrichtingen. Bovendien hebben we aangetoond dat de tanden van verschillende ontwikkelingsstadia handhaven in deze in vitro omstandigheden dezelfde afstotende of aantrekkelijke effecten trigeminal innervatie zij vertonen in vivo ^37. Dit protocol geeft informatie over eenvoudige, krachtige en flexibele manier om co-cultuur ganglia / zenuwen en doelweefsels en de rollen van specifieke moleculen studie over dergelijke interacties in een gecontroleerde en geïsoleerde omgeving.

Protocol

Alle muizen werden onderhouden en behandeld volgens de Zwitserse Animal Welfare wet en in overeenstemming met de voorschriften van de kantonrechter Veterinair Bureau, Zürich. 1. Voorbereiding van de Dissection Material, Cultuur Media, microfluïdische apparaten Autoclaaf micro-dissectie pincet en een schaar (121 ° C, sterilisatie: 20 min) en bewaar ze in een steriele container. Steriliseer dekglaasjes (24 mm x 24 mm) door te incuberen in 1 M HCl gedurende 24 uur op een…

Representative Results

Deze resultaten tonen aan dat geïsoleerde trigeminale ganglia kan groeien in een compartiment van de microfluïdische inrichting en bovendien, dat de ontwikkeling van de geïsoleerde tandkiemen blijft gedurende langere tijd in het andere compartiment van de microfluïdische apparaat. Verschillende kweekmedia worden in de twee compartimenten en de microgroeven tussen de twee compartimenten mogelijk verlenging van axon van het trigeminale ganglion tegenover de ontwikkelingslanden tandkiemen. Figuur 3 is …

Discussion

Vorige in vitro studies van de tand innervatie waren gebaseerd op conventionele co-culturen van de ganglia semilunares en tandheelkundige weefsels of cellen ^26,28,29. Deze studies werden uitgevoerd om vooral de aantrekkelijke effecten van deze cellen of weefsels voor sensorische axons ³⁸ onderzoeken. Hoewel het brengen van significante vooruitgang in het veld, werden verschillende technische kwesties. Tooth kiemen beginnen te ontaarden na enkele dagen van de cultuur ^37. Op basis…

Materials

AXIS Axon Isolation Devices	Millipore	AX15010-TC	Microchannels of different lenght are available
Laminin	Sigma Aldrich	L2020
Neurobasal	Gibco	21103-049
B27	Gibco	17504
Recombinant Mouse beta-NGF	R&D Systems	1156-NG-100	Human and Rat beta-NGF (R&D Systems) are equivalent
DMEM-F12	Gibco	11320-033