Mikroakışkan Co-kültür Aygıtları Kullanma Diş Germ innervasyon Geliştirme Analizi
Summary
Co-cultures represent a valuable method to study the interactions between nerves and target tissues and organs. Microfluidic systems allow co-culturing ganglia and whole developing organs or tissues in different culture media, thus representing a valuable tool for the in vitro study of the crosstalk between neurons and their targets.
Abstract
Inervasyonu organ ve dokuların gelişimi, homeostasis ve rejenerasyonda önemli bir rol oynar. Ancak bu olayları altta yatan mekanizmalar henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Özellikle, diş gelişimi ve rejenerasyon innervasyonunun rolü ihmal edilmektedir.
In vivo çalışmalar birçok değişik hayvan modellerinin geliştirilmesi ve onarım işlemleri sırasında diş dokularının innervasyon desen hakkında önemli bilgiler vermiştir. Ancak, bu yaklaşımların pek çok sinir lifleri ve hedef organ ve doku arasındaki etkileşimin moleküler temelini vurgulamak için optimal değildir.
Eş-kültür araştırılması ve kontrollü ve yalıtılmış bir ortamda sinir lifleri ve dişlerin arasındaki etkileşimleri işlemek için değerli bir yöntem teşkil etmektedir. Son yıllarda, aynı kültür ortamı kullanılarak geleneksel eş-kültürleri çok kısa süreler için yapılmıştır (örneğin, iki gün)duyusal sinir lifleri üzerinde ağız ve diş dokularının gelişiminin çekici veya itici etkisini araştırmaktır. Ancak, kültür süresinin uzatma diş morfolojilerinden ve hücrelerdeki farklılaşmanın üzerindeki innervasyonunun etkilerini araştırmak için gereklidir.
Microfluidics sistemleri, uygun bir kültür ortamı nöronların ve farklı hücre tipleri arasında ko-kültürler izin verir. Son zamanlarda, trigeminal gangliyon (TG) ve diş uzun bir süre hayatta mümkün olduğunu göstermiştir birlikte kültüre edildiğinde, mikroakışkan cihazlarda, ve bu koşullar altında da in vivo olarak gösterir, aynı innervasyon deseni korumak.
Bu temelde, biz izole etmek ve bir mikroakışkan ko-kültürü sistemi kullanmaktadır.Bu protokolde trigeminal ganglion ve diş mikropları gelişmekte ko-kültür basit ve esnek bir yol için ortak kültür ganglionlar / sinirler ve hedef doku ve açıklar anlatan rolleri incelemek için Bir Contr tür etkileşimler üzerinde özel moleküllerolled ve izole bir ortam.
Introduction
Inervasyonu organ ve dokularda 1,2 geliştirilmesi, homeostasis ve rejenerasyonda önemli bir rol oynar. 5 – Ayrıca, innervasyon kök hücre proliferasyonu, mobilizasyon ve farklılaşma 3 düzenlenmesinde rol oynar. Gerçekten de, orofasyal kompleks dokularda gerçekleştirilen son çalışmalar parasempatik sinir tükürük geliştirilmesi ve rejenerasyonu 6,7 bezleri içinde epitel progenitör hücrelerin fonksiyonu için gerekli olduğunu göstermiştir. 11 – Aynı şekilde, innervasyon damak 8 gelişimi ve korunması için gerekli olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, bu gibi dişler gibi diğer önemli orofasyal organ ve dokuların gelişimi innervasyon yapılmamış ihmal rolünü analiz etmek önemlidir.
Yetişkin dişi zengin innervasyon rağmen, ve buna karşılık vücut develo tüm diğer organ ve dokularaping dişler erken doğum aşamalarında innerve başlanacak. Dişler ağız ektoderm ve kranial nöral krest kökenli mezenşimin arasındaki sıralı ve karşılıklı etkileşimleri sonucunda gelişir. Bu etkileşimler, epitel türevli ameloblast ve mine ve dentine sırasıyla 12 oluşumundan sorumlu olan mezenşimin türetilmiş odontoblast yol açar. 15 – Üstün servikal ganglionlar gelen trigeminal ganglia ve sempatik sinirler duyu sinirleri yetişkin dişleri 13 innerve. Embriyogenez sırasında sinir lifleri gelişmekte diş mikrop karşı trigeminal ganglion projeden kaynaklanan ve giderek onları çevreleyen ama diş papilla mezenşimin 13 içine nüfuz etmez. Sinir lifleri odontoblast farklılaşma ve dentin matriks birikimi 16 ile ilişkili daha ileri gelişim aşamalarında diş pulpa mezenşimi girin. Diş hamuru innervasyon completed yakında ağız boşluğunda 13 diş patlaması sonucu. 19 – Çeşitli semaphorins ve nörotrofinler Odontogenez 16 sırasında innervasyon düzenlenmesinde rol oynadığını Önceki çalışmalar ortaya koymuştur. Daha önceki çalışmalarda açıkça innervasyon balıkların 20 diş oluşumu için bir ön koşul olduğunu göstermiştir. Daha yeni çalışmalar sonik kirpi (sus) 21 salgılanması yoluyla duyusal sinirler tarafından düzenlenir fare kesici diş mezenşimin kök hücrelerin bu homeostasisi göstermiştir. 24 – Bununla birlikte, diş başlatma, geliştirme ve yenilenme içinde innervasyon rolü hala memelilerde 22 derece tartışmalıdır.
In vivo çalışmalarda bir bolluk, çeşitli hayvan modellerinde 13,25,26 geliştirme ve onarım işlemleri sırasında diş dokularının innervasyon desen hakkında önemli bilgiler vermiştir. Bununla birlikte, bu en APPROağrıları sinir lifleri ve hedef organ ve doku arasındaki etkileşimin moleküler temelini vurgulamak için optimal değildir. 29 – Co-kültürler araştırılması ve kontrollü ve yalıtılmış bir ortamda 26 sinir lifleri ve dişlerin arasındaki etkileşimleri işlemek için değerli bir yöntem teşkil etmektedir. Aynı zamanda, eş-kültürleme çeşitli teknik ayarlamalar tabidir. 32 – Örneğin, sinirler ve spesifik diş dokularının (örneğin, diş hamuru, diş folikül, diş epiteli) için çoğu zaman 30 uzun süreler için doku hayatta garanti etmek amacıyla farklı bir kültür ortamı gerektirir.
29 – Son yıllarda, aynı kültür ortamı kullanılarak geleneksel eş-kültürler duyusal sinir lifleri 27 ağız ve diş dokularının gelişiminin çekici veya itici etkilerini araştırmak için çok kısa bir süre (örneğin, iki gün) için yapılmıştır.Ancak, kültür süresinin uzatma diş morfolojilerinden ve hücrelerdeki farklılaşmanın üzerindeki innervasyonunun etkilerini araştırmak ve hedef organlarda içinde dallanma sinir liflerinin dinamiklerini incelemek için gereklidir. Bu nedenle, bitişik olmayan ko-kültürler nöronal-diş dokuları etkileşimler çalışmalar yapmak daha uygun olacaktır.
Microfluidics sistemleri, uygun bir kültür ortamı nöronların ve farklı hücre tipleri arasında ko-kültürler izin verir. Hedef doku 33 içeren bölmeye doğru mikrokanallar boyunca nöral hücre kütlelerinden aksonlarının gelişimini izin verirken, bu cihazlarda, diş dokuları ve nöronlar farklı bölümlerinde ayrılır. Mikroakışkan cihaz zaten kanser ve neovaskülarizasyon 35 hücre etkileşimleri nöronlar ve mikroglia 34,35 arasındaki etkileşimleri hem de hücre incelemek için kullanılmıştır. Ayrıca, bu sistemler Dors'a arasındaki etkileşimi incelemek için kullanılmıştıral kök gangliyon ve osteoblastlar 36.
Biz son zamanlarda trigeminal gangliyon (TG) ve diş uzun süre hayatta kalmak için mümkün olduğunu göstermiştir zaman birlikte kültüre mikroakışkan cihazlar 37. Ayrıca, biz farklı gelişim aşamalarında dişler bu in vitro koşullarda bunlar, in vivo 37 göstermek trigeminal inervasyon aynı itici ya da çekici efektler korumak olduğunu göstermiştir. Bu protokol, basit, güçlü ve esnek bir şekilde birlikte kültür ganglionlar / sinirler ve hedef doku ve kontrollü ve yalıtılmış bir ortamda bu tür etkileşimler ile ilgili özel moleküllerin rollerini incelemek için hakkında bilgi sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diş innervasyon in vitro çalışmalar mi, trigeminal ganglionların diş dokuları veya hücreleri 26,28,29 geleneksel ko-kültürler dayandırılmıştır. Bu çalışmalar çoğunlukla duyusal aksonlar 38 bu hücrelerin veya dokuların çekici etkisini araştırmak amacıyla yapılmıştır. Alanda önemli ilerlemeler getirerek rağmen, çeşitli teknik sorunlar dile getirildi. Diş mikroplar kültür 37 birkaç gün sonra dejenere başlar. Bu gözlemlere dayanarak, aynı k?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was funded by the University of Zurich. The authors would like to thank Estrela Neto and Dr. Meriem Lamghari for helping in establishing the co-culture conditions.
Materials
| AXIS Axon Isolation Devices | Millipore | AX15010-TC | Microchannels of different lenght are available |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| B27 | Gibco | 17504 | |
| Recombinant Mouse beta-NGF | R&D Systems | 1156-NG-100 | Human and Rat beta-NGF (R&D Systems) are equivalent |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320-033 |
References
- Pagella, P., Jiménez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 71, 2241-2251 (2014).
- Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends in neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).
- Brownell, I., Guevara, E., Bai, C. B., Loomis, C. A., Joyner, A. L. Nerve-derived sonic hedgehog defines a niche for hair follicle stem cells capable of becoming epidermal stem cells. Cell stem cell. 8 (5), 552-565 (2011).
- Katayama, Y., Battista, M., et al. Signals from the sympathetic nervous system regulate hematopoietic stem cell egress from bone marrow. Cell. 124 (2), 407-421 (2006).
- Fitch, S. R., Kimber, G. M., et al. Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis. Cell stem cell. 11 (4), 554-566 (2012).
- Knox, S. M., Lombaert, I. M. a., Reed, X., Vitale-Cross, L., Gutkind, J. S., Hoffman, M. P. Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. Science(New York, N.Y.). 329 (5999), 1645-1647 (2010).
- Knox, S. M., Lombaert, I. M. A., et al. Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration. Nature communications. 4, 1494 (2013).
- Oakley, B., Witt, M. Building sensory receptors on the tongue. Journal of neurocytology. 33 (6), 631-646 (2004).
- Oakley, B., Brandemihl, A., Cooper, D., Lau, D., Lawton, A., Zhang, C. The morphogenesis of mouse vallate gustatory epithelium and taste buds requires BDNF-dependent taste neurons. Brain research. Developmental brain research. 105 (1), 85-96 (1998).
- Sun, H., Oakley, B. Development of anterior gustatory epithelia in the palate and tongue requires epidermal growth factor receptor. Developmental biology. 242 (1), 31-43 (2002).
- Mistretta, C. M., Goosens, K. a., Farinas, I., Reichardt, L. F. Alterations in size, number, and morphology of gustatory papillae and taste buds in BDNF null mutant mice demonstrate neural dependence of developing taste organs. The Journal of comparative neurology. 409 (1), 13-24 (1999).
- Mitsiadis, T. a., Graf, D. Cell fate determination during tooth development and regeneration. Birth defects research. Part C, Embryo today reviews. 87 (3), 199-211 (2009).
- Mohamed, S. S., Atkinson, M. E. A histological study of the innervation of developing mouse teeth. Journal of anatomy. 136 (Pt 4), 735-749 (1983).
- Luukko, K. Immunohistochemical localization of nerve fibres during development of embryonic rat molar using peripherin and protein gene product 9.5 antibodies. Archives of oral biology. 42 (3), 189-195 (1997).
- Johnsen, D. Innervation of teeth: qualitative, quantitative, and developmental assessment. Journal of dental research. 64, 555-563 (1985).
- Mitsiadis, T. a., Dicou, E., Joffre, A., Magloire, H. Immunohistochemical localization of nerve growth factor (NGF) and NGF receptor (NGF-R) in the developing first molar tooth of the rat. Differentiation; research in biological diversity. 49 (1), 47-61 (1992).
- Mitsiadis, T. a., Luukko, K. Neurotrophins in odontogenesis. The International journal of developmental biology. 39 (1), 0214-6282 (1995).
- Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation. Differentiation; research in biological diversity. 84 (5), 371-379 (2012).
- Kettunen, P., Løes, S., et al. Coordination of trigeminal axon navigation and patterning with tooth organ formation: epithelial-mesenchymal interactions and epithelial Wnt4 and Tgfbeta1 regulate semaphorin 3a expression in the dental mesenchyme. Development (Cambridge, England). 132 (2), 323-334 (2005).
- Tuisku, F., Hildebrand, C. Evidence for a neural influence on tooth germ generation in a polyphyodont species. Developmental biology. 165, 1-9 (1994).
- Zhao, H., Feng, J., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell stem cell. 14 (2), 160-173 (2014).
- Kettunen, P., Kvinnsland, H., Luukko, K. Mouse rudimentary diastema tooth primordia are devoid of peripheral nerve fibers. Anatomy and embryology. 205 (3), 187-191 (2002).
- Lumsend, A., Buchanan, J. An experimental study of timing and topography of early tooth development in the mouse embryo. Archives of oral biology. , 301-311 (1986).
- Kollar, E., Lumsend, A. Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation. Journal de Biologia Buccale. 7 (1), 49-60 (1979).
- Luukko, K., Kettunen, P. Coordination of tooth morphogenesis and neuronal development through tissue interactions: lessons from mouse models. Experimental cell research. 325 (2), 72-77 (2014).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro. Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).
- Lumsend, A., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323 (9), 538-539 (1986).
- Lillesaar, C., Fried, K. Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage. Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro. Neuroscience letters. 308 (3), 161-164 (2001).
- Petrinovic, M. M., Duncan, C. S., et al. Neuronal Nogo-A regulates neurite fasciculation, branching and extension in the developing nervous system. Development(Cambridge, England). 137 (15), 2539-2550 (2010).
- Otsu, K., Fujiwara, N., Harada, H. Odontogenesis. Methods in Molecular Biology. 887, (2012).
- Mitsiadis, T. a., Drouin, J. Deletion of the Pitx1 genomic locus affects mandibular tooth morphogenesis and expression of the Barx1 and Tbx1 genes. Developmental biology. 313 (2), 887-896 (2008).
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).
- Hosmane, S., Tegenge, M. A., et al. Toll/interleukin-1 receptor domain-containing adapter inducing interferon-β mediates microglial phagocytosis of degenerating axons. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (22), 7745-7757 (2012).
- Delamarche, E., Tonna, N., Lovchik, R. D., Bianco, F., Matteoli, M. Pharmacology on microfluidics: multimodal analysis for studying celll-cell interaction. Current opinion in pharmacology. 13 (5), 821-828 (2013).
- Neto, E., Alves, C. J., et al. Sensory neurons and osteoblasts: close partners in a microfluidic environment. Integrative Biology. , (2014).
- Pagella, P., Neto, E., Jiménez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation. Frontiers in physiology. 5 (August), (2014).
- Connor, R., Tessier-Lavigne, M. Identification of maxillary factor, a maxillary process-derived chemoattractant for developing trigeminal sensory axons. Neuron. 24, 165-178 (1999).
