Análisis de Desarrollo del diente Germ Inervación Uso de dispositivos de microfluidos Co-cultura
Summary
Co-cultures represent a valuable method to study the interactions between nerves and target tissues and organs. Microfluidic systems allow co-culturing ganglia and whole developing organs or tissues in different culture media, thus representing a valuable tool for the in vitro study of the crosstalk between neurons and their targets.
Abstract
Inervación juega un papel clave en el desarrollo, la homeostasis y la regeneración de órganos y tejidos. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a estos fenómenos no son bien entendidos todavía. En particular, se descuida el papel de la inervación en desarrollo de los dientes y la regeneración.
Varios estudios in vivo han proporcionado información importante acerca de los patrones de inervación de los tejidos dentales durante los procesos de desarrollo y reparación de diversos modelos animales. Sin embargo, la mayoría de estos enfoques no son óptimas para resaltar las bases moleculares de las interacciones entre las fibras nerviosas y órganos diana y tejidos.
Co-culturas constituyen un valioso método para investigar y manipular las interacciones entre las fibras nerviosas y los dientes en un ambiente controlado y aislado. En las últimas décadas, se han realizado co-cultivos convencionales utilizando el mismo medio de cultivo durante períodos muy cortos (por ejemplo, dos días)para investigar los efectos de atracción o repulsión de desarrollar tejidos bucales y dentales en las fibras nerviosas sensoriales. Sin embargo, se requiere la extensión del período de cultivo para investigar los efectos de la inervación de la morfogénesis y dientes citodiferenciación.
Sistemas de microfluidos permiten co-cultivos de neuronas y diferentes tipos de células en su medio de cultivo apropiado. Hemos demostrado recientemente que los ganglios del trigémino (TG) y los dientes son capaces de sobrevivir durante un largo período de tiempo cuando se co-cultivaron en dispositivos de microfluidos, y que se mantienen en estas condiciones el mismo patrón de inervación que muestran in vivo.
Sobre esta base, se describe cómo aislar y co-desarrollo de la cultura y de los ganglios del trigémino diente gérmenes en el protocolo de un co-cultivo de microfluidos sistema.Este describe una forma simple y flexible para co-cultura ganglios / nervios y los tejidos diana y para estudiar los papeles de moléculas específicas sobre tales interacciones en un controlled y entorno aislado.
Introduction
Inervación juega un papel clave en el desarrollo, la homeostasis y la regeneración de órganos y tejidos 1,2. Además, la inervación está implicado en la regulación de la proliferación de células madre, la movilización y diferenciación 3 – 5 de. De hecho, estudios recientes realizados en los tejidos del complejo orofacial han demostrado que los nervios parasimpáticos son necesarios para la función de las células progenitoras epiteliales durante el desarrollo y la regeneración de la glándulas salivales 6,7. Del mismo modo, se ha demostrado que la inervación es necesaria para el desarrollo y mantenimiento de las papilas gustativas 8-11. Por lo tanto, es importante analizar los papeles todavía descuidados de la inervación en el desarrollo de otros órganos y tejidos orofaciales importantes tales como dientes.
A pesar de la rica inervación de los dientes adultos, y en contraste con todos los demás órganos y tejidos del cuerpo, Develode ping dientes comienzan a ser inervado en las etapas postnatales tempranas. Los dientes se desarrollan como resultado de las interacciones secuenciales y recíproca entre el ectodermo oral y craneal mesénquima derivadas de la cresta neural. Estas interacciones dan lugar a ameloblastos epiteliales derivadas de mesénquima y odontoblastos derivados que son responsables de la formación del esmalte y la dentina, respectivamente 12. Los nervios sensoriales de los ganglios del trigémino y los nervios simpáticos de los ganglios cervicales superiores inervan los dientes adultos 13-15. Durante la embriogénesis, las fibras nerviosas que emana del proyecto ganglios del trigémino hacia los gérmenes dentales en desarrollo y progresivamente los rodean, pero que no penetran en el mesénquima papila dental 13. Las fibras nerviosas entran en el mesénquima de pasta dental en las etapas de desarrollo más avanzados que se correlacionan con la diferenciación de odontoblastos y la matriz de dentina deposición 16. Inervación pulpa dental es complETED poco después de la erupción del diente en la cavidad oral 13. Estudios anteriores han revelado que varios semaforinas y las neurotrofinas están implicadas en la regulación de la inervación durante odontogenesis 16-19. Estudios anteriores han demostrado claramente que la inervación es un requisito previo para la formación de los dientes en los peces 20. Estudios más recientes han demostrado que la homeostasis de las células madre mesenquimales dental en incisivos ratón está regulada por los nervios sensoriales a través de la secreción de sonic hedgehog (Shh) 21. Sin embargo, el papel de la inervación en diente de iniciación, el desarrollo y la regeneración es todavía muy controvertido en mamíferos 22-24.
Una gran cantidad de estudios in vivo han proporcionado información importante acerca de los patrones de inervación de los tejidos dentales durante los procesos de desarrollo y reparación de diversos modelos animales 13,25,26. Sin embargo, la mayoría de estos APPROdolores no son óptimas para resaltar las bases moleculares de las interacciones entre las fibras nerviosas y órganos diana y tejidos. Co-culturas constituyen un valioso método para investigar y manipular las interacciones entre las fibras nerviosas y los dientes en un ambiente controlado y aislado 26-29. Al mismo tiempo, co-cultivo está sujeto a diversos ajustes técnicos. Por ejemplo, los nervios y los tejidos dentales específicos (por ejemplo, la pulpa dental, folículo dental, epitelio dental) a menudo requieren diferentes medios de cultivo con el fin de garantizar la supervivencia del tejido durante largos períodos de tiempo 30-32.
En las últimas décadas, se han realizado co-cultivos convencionales utilizando el mismo medio de cultivo durante períodos muy cortos (por ejemplo, dos días) para investigar los efectos de atracción o repulsión de desarrollar tejidos bucales y dentales en las fibras nerviosas sensoriales 27-29.Sin embargo, se requiere la extensión del período de cultivo para investigar los efectos de la inervación de la morfogénesis y dientes citodiferenciación, y para estudiar la dinámica de las fibras nerviosas se ramifican en los órganos diana. Por lo tanto, co-cultivos no contiguos serían más adecuados para llevar a cabo estudios sobre neuronales dental tejidos interacciones.
Sistemas de microfluidos permiten co-cultivos de neuronas y diferentes tipos de células en su medio de cultivo apropiado. En estos dispositivos, los tejidos dentales y las neuronas se separan en diferentes compartimentos, mientras que permite el crecimiento de los axones de los cuerpos de las células neuronales a través de microcanales hacia el compartimento que contiene su tejido diana 33. Los dispositivos microfluídicos han sido ya utilizado para estudiar las interacciones entre las neuronas y la microglia 34,35, así como interacciones célula a célula en el cáncer y la neovascularización 35. Además, estos sistemas se han utilizado para estudiar las interacciones entre dorsal ganglios de la raíz y osteoblastos 36.
Hemos demostrado recientemente que los ganglios del trigémino (TG) y los dientes son capaces de sobrevivir por largos períodos de tiempo cuando se co-cultivaron en dispositivos de microfluidos 37. Por otra parte, hemos demostrado que los dientes de las diferentes etapas de desarrollo mantienen en estas condiciones in vitro los mismos efectos repulsivas o atractivas en la inervación del trigémino que muestran in vivo 37. Este protocolo proporciona información acerca de una forma sencilla, potente y flexible para co-cultura ganglios / nervios y los tejidos diana y para estudiar los papeles de moléculas específicas en tales interacciones en un ambiente controlado y aislado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anterior en estudios in vitro de la inervación de los dientes estaban basados en co-cultivos convencionales de los ganglios del trigémino y los tejidos o células 26,28,29 dentales. Estos estudios se realizaron para investigar principalmente los efectos atractivos de estas células o tejidos en los axones sensoriales 38. Aunque trayendo avances significativos en el campo, se plantearon varias cuestiones técnicas. Gérmenes de dientes empiezan a degenerar después de pocos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was funded by the University of Zurich. The authors would like to thank Estrela Neto and Dr. Meriem Lamghari for helping in establishing the co-culture conditions.
Materials
| AXIS Axon Isolation Devices | Millipore | AX15010-TC | Microchannels of different lenght are available |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| B27 | Gibco | 17504 | |
| Recombinant Mouse beta-NGF | R&D Systems | 1156-NG-100 | Human and Rat beta-NGF (R&D Systems) are equivalent |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320-033 |
References
- Pagella, P., Jiménez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 71, 2241-2251 (2014).
- Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends in neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).
- Brownell, I., Guevara, E., Bai, C. B., Loomis, C. A., Joyner, A. L. Nerve-derived sonic hedgehog defines a niche for hair follicle stem cells capable of becoming epidermal stem cells. Cell stem cell. 8 (5), 552-565 (2011).
- Katayama, Y., Battista, M., et al. Signals from the sympathetic nervous system regulate hematopoietic stem cell egress from bone marrow. Cell. 124 (2), 407-421 (2006).
- Fitch, S. R., Kimber, G. M., et al. Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis. Cell stem cell. 11 (4), 554-566 (2012).
- Knox, S. M., Lombaert, I. M. a., Reed, X., Vitale-Cross, L., Gutkind, J. S., Hoffman, M. P. Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. Science(New York, N.Y.). 329 (5999), 1645-1647 (2010).
- Knox, S. M., Lombaert, I. M. A., et al. Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration. Nature communications. 4, 1494 (2013).
- Oakley, B., Witt, M. Building sensory receptors on the tongue. Journal of neurocytology. 33 (6), 631-646 (2004).
- Oakley, B., Brandemihl, A., Cooper, D., Lau, D., Lawton, A., Zhang, C. The morphogenesis of mouse vallate gustatory epithelium and taste buds requires BDNF-dependent taste neurons. Brain research. Developmental brain research. 105 (1), 85-96 (1998).
- Sun, H., Oakley, B. Development of anterior gustatory epithelia in the palate and tongue requires epidermal growth factor receptor. Developmental biology. 242 (1), 31-43 (2002).
- Mistretta, C. M., Goosens, K. a., Farinas, I., Reichardt, L. F. Alterations in size, number, and morphology of gustatory papillae and taste buds in BDNF null mutant mice demonstrate neural dependence of developing taste organs. The Journal of comparative neurology. 409 (1), 13-24 (1999).
- Mitsiadis, T. a., Graf, D. Cell fate determination during tooth development and regeneration. Birth defects research. Part C, Embryo today reviews. 87 (3), 199-211 (2009).
- Mohamed, S. S., Atkinson, M. E. A histological study of the innervation of developing mouse teeth. Journal of anatomy. 136 (Pt 4), 735-749 (1983).
- Luukko, K. Immunohistochemical localization of nerve fibres during development of embryonic rat molar using peripherin and protein gene product 9.5 antibodies. Archives of oral biology. 42 (3), 189-195 (1997).
- Johnsen, D. Innervation of teeth: qualitative, quantitative, and developmental assessment. Journal of dental research. 64, 555-563 (1985).
- Mitsiadis, T. a., Dicou, E., Joffre, A., Magloire, H. Immunohistochemical localization of nerve growth factor (NGF) and NGF receptor (NGF-R) in the developing first molar tooth of the rat. Differentiation; research in biological diversity. 49 (1), 47-61 (1992).
- Mitsiadis, T. a., Luukko, K. Neurotrophins in odontogenesis. The International journal of developmental biology. 39 (1), 0214-6282 (1995).
- Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation. Differentiation; research in biological diversity. 84 (5), 371-379 (2012).
- Kettunen, P., Løes, S., et al. Coordination of trigeminal axon navigation and patterning with tooth organ formation: epithelial-mesenchymal interactions and epithelial Wnt4 and Tgfbeta1 regulate semaphorin 3a expression in the dental mesenchyme. Development (Cambridge, England). 132 (2), 323-334 (2005).
- Tuisku, F., Hildebrand, C. Evidence for a neural influence on tooth germ generation in a polyphyodont species. Developmental biology. 165, 1-9 (1994).
- Zhao, H., Feng, J., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell stem cell. 14 (2), 160-173 (2014).
- Kettunen, P., Kvinnsland, H., Luukko, K. Mouse rudimentary diastema tooth primordia are devoid of peripheral nerve fibers. Anatomy and embryology. 205 (3), 187-191 (2002).
- Lumsend, A., Buchanan, J. An experimental study of timing and topography of early tooth development in the mouse embryo. Archives of oral biology. , 301-311 (1986).
- Kollar, E., Lumsend, A. Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation. Journal de Biologia Buccale. 7 (1), 49-60 (1979).
- Luukko, K., Kettunen, P. Coordination of tooth morphogenesis and neuronal development through tissue interactions: lessons from mouse models. Experimental cell research. 325 (2), 72-77 (2014).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro. Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).
- Lumsend, A., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323 (9), 538-539 (1986).
- Lillesaar, C., Fried, K. Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage. Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro. Neuroscience letters. 308 (3), 161-164 (2001).
- Petrinovic, M. M., Duncan, C. S., et al. Neuronal Nogo-A regulates neurite fasciculation, branching and extension in the developing nervous system. Development(Cambridge, England). 137 (15), 2539-2550 (2010).
- Otsu, K., Fujiwara, N., Harada, H. Odontogenesis. Methods in Molecular Biology. 887, (2012).
- Mitsiadis, T. a., Drouin, J. Deletion of the Pitx1 genomic locus affects mandibular tooth morphogenesis and expression of the Barx1 and Tbx1 genes. Developmental biology. 313 (2), 887-896 (2008).
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).
- Hosmane, S., Tegenge, M. A., et al. Toll/interleukin-1 receptor domain-containing adapter inducing interferon-β mediates microglial phagocytosis of degenerating axons. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (22), 7745-7757 (2012).
- Delamarche, E., Tonna, N., Lovchik, R. D., Bianco, F., Matteoli, M. Pharmacology on microfluidics: multimodal analysis for studying celll-cell interaction. Current opinion in pharmacology. 13 (5), 821-828 (2013).
- Neto, E., Alves, C. J., et al. Sensory neurons and osteoblasts: close partners in a microfluidic environment. Integrative Biology. , (2014).
- Pagella, P., Neto, E., Jiménez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation. Frontiers in physiology. 5 (August), (2014).
- Connor, R., Tessier-Lavigne, M. Identification of maxillary factor, a maxillary process-derived chemoattractant for developing trigeminal sensory axons. Neuron. 24, 165-178 (1999).
