Analyse de développement germe dentaire innervation Utilisation de périphériques Co-culture microfluidique

Summary

Co-cultures represent a valuable method to study the interactions between nerves and target tissues and organs. Microfluidic systems allow co-culturing ganglia and whole developing organs or tissues in different culture media, thus representing a valuable tool for the in vitro study of the crosstalk between neurons and their targets.

Abstract

Innervation joue un rôle clé dans le développement, l'homéostasie et la régénération des organes et des tissus. Cependant, les mécanismes sous-jacents de ces phénomènes ne sont pas encore bien compris. En particulier, le rôle dans le développement de l'innervation de la dent et la régénération est négligée.

Plusieurs études in vivo ont fourni des informations importantes sur les motifs de l'innervation des tissus dentaires au cours des processus de développement et de réparation de divers modèles animaux. Cependant, la plupart de ces approches ne sont pas optimales pour mettre en évidence la base moléculaire des interactions entre les fibres nerveuses et les organes et tissus cibles.

Co-cultures constituent une méthode utile pour étudier et manipuler les interactions entre les fibres nerveuses et des dents dans un environnement contrôlé et isolé. Au cours des dernières décennies, les co-cultures classiques en utilisant le même milieu de culture ont été effectués pendant des périodes très courtes (par exemple, deux jours)pour étudier les effets attractives ou répulsives de développer des tissus buccaux et dentaires sur les fibres nerveuses sensorielles. Cependant, l'extension de la période de culture est nécessaire pour étudier les effets de l'innervation sur la morphogenèse de la dent et cytodifférenciation.

systèmes microfluidiques permettent des co-cultures de neurones et de différents types de cellules dans leur milieu de culture approprié. Nous avons montré récemment que les ganglions trigéminés (TG) et les dents sont en mesure de survivre pendant une longue période de temps lorsqu'ils sont co-cultivées dans des dispositifs microfluidiques, et qu'ils maintiennent dans ces conditions, le même schéma d'innervation ils montrent que in vivo.

Sur cette base, nous décrivons comment isoler et de co-culture et le développement de ganglions dents germes trijumeau dans le protocole de co-culture microfluidique décrit un moyen simple et flexible pour la co-culture ganglions / nerfs et les tissus cibles et d'étudier les rôles de molécules spécifiques sur ces interactions dans un controlled et environnement isolé.

Introduction

Innervation joue un rôle clé dans le développement, l'homéostasie et la régénération des organes et des tissus ^1,2. En outre, l'innervation est impliquée dans la régulation de la prolifération des cellules souches, la mobilisation et la différenciation ^3-5. En effet, des études récentes réalisées dans les tissus du complexe orofaciale ont montré que les nerfs parasympathiques sont nécessaires pour la fonction épithéliale de cellules souches au cours du développement et de la régénération glandes salivaires ^6,7. De même, il a été démontré que l'innervation est nécessaire pour le développement et l'entretien des papilles ^8-11. Ainsi, il est important d'analyser le rôle de l'innervation encore négligées dans le développement d'autres organes et tissus oro-faciales importants tels que des dents.

En dépit de la richesse de l'innervation dents d'adulte, et contrairement à tous les autres organes et tissus du corps, developing dents commencent à être innervée au stade de la post-natales premiers. Les dents se développent en raison des interactions séquentielles et réciproques entre l'ectoderme oral et crânienne neuronal mésenchyme de la crête dérivés. Ces interactions donnent lieu à adamantoblastes épithéliales dérivées et les odontoblastes mésenchymateuses dérivées qui sont responsables de la formation de l'émail et de la dentine, ¹² respectivement. Les nerfs sensoriels du ganglion de Gasser et les nerfs sympathiques du ganglion cervical supérieur innervent les dents d'adultes ^{de 13 à 15.} Au cours de l'embryogenèse, les fibres nerveuses émanant du projet de ganglions de Gasser vers les germes dentaires développement et progressivement entourer eux, mais ils ne pénètrent pas dans la papille mésenchyme dentaire ^13. Les fibres nerveuses pénètrent dans la pulpe dentaire mésenchyme à des stades de développement plus avancés qui sont en corrélation avec la différenciation des odontoblastes et la matrice de la dentine dépôt ^16. Pulpe dentaire innervation est complETED peu de temps après l'éruption des dents dans la cavité buccale ^13. Des études antérieures ont révélé que divers sémaphorines et neurotrophines sont impliqués dans la régulation de l'innervation cours odontogenèse ^16-19. Des études antérieures ont clairement démontré que l'innervation est une condition préalable à la formation des dents chez les poissons ^20. Des études plus récentes ont montré que l'homéostasie des cellules souches mésenchymateuses dentaire dans incisives de souris est réglementée par les nerfs sensoriels via la sécrétion de sonic hedgehog (Shh) ^21. Néanmoins, le rôle de l'innervation de la dent initiation, le développement et la régénération est encore très controversée chez les mammifères ^{22 – 24.}

Une pléthore d'études in vivo ont fourni des informations importantes sur les motifs de l'innervation des tissus dentaires au cours des processus de développement et de réparation de divers modèles animaux ^13,25,26. Cependant, la plupart de ces Approdes maux ne sont pas optimales pour mettre en évidence la base moléculaire des interactions entre les fibres nerveuses et les organes et tissus cibles. Co-cultures constituent une méthode utile pour étudier et manipuler les interactions entre les fibres nerveuses et des dents dans un environnement contrôlé et isolé ^{de 26 à 29.} Dans le même temps, la co-culture est soumise à diverses adaptations techniques. Par exemple, les nerfs et les tissus dentaires spécifiques (par exemple, la pulpe dentaire, follicule dentaire, l'épithélium dentaire) nécessitent souvent différents milieux de culture afin de garantir la survie des tissus pendant de longues périodes de temps ^30-32.

Dans les dernières décennies, les co-cultures conventionnelles utilisant le même milieu de culture ont été effectués pour des périodes très courtes (par exemple, deux jours) pour étudier les effets attractives ou répulsives de développer des tissus buccaux et dentaires sur les fibres nerveuses sensorielles ^27-29.Cependant, l'extension de la période de culture est nécessaire pour étudier les effets de l'innervation sur la morphogenèse de la dent et cytodifférenciation, et d'étudier la dynamique de fibres nerveuses de branchement dans les organes cibles. Par conséquent, les co-cultures non-contigus serait plus approprié de réaliser des études sur des tissus interactions neuronales-dentaire.

systèmes microfluidiques permettent des co-cultures de neurones et de différents types de cellules dans leur milieu de culture approprié. Dans ces dispositifs, les tissus dentaires et les neurones sont séparés dans des compartiments différents, tout en permettant la croissance des axones dans les corps cellulaires neuronaux à travers des microcanaux vers le compartiment contenant leur tissu cible ^33. Les dispositifs microfluidiques ont déjà été utilisées pour étudier les interactions entre les neurones et les microglies ^34,35, ainsi que des cellules à des interactions cellulaires dans le cancer et la néovascularisation ^35. En outre, ces systèmes ont été utilisés pour étudier les interactions entre dorsal ganglions de la racine et les ostéoblastes ^36.

Nous avons démontré récemment que les ganglions de Gasser (TG) et les dents sont capables de survivre pendant de longues périodes de temps en cas de co-cultivées dans des dispositifs microfluidiques ^37. De plus, nous avons démontré que les dents de différents stades de développement de maintenir dans ces conditions in vitro les mêmes effets répulsifs ou attractifs sur innervation trijumeau qu'ils montrent in vivo ^37. Ce protocole fournit des informations sur un moyen simple, puissant et flexible de co-culture ganglions / nerfs et les tissus cibles et d'étudier les rôles des molécules spécifiques sur ces interactions dans un environnement contrôlé et isolé.

Protocol

Toutes les souris ont été maintenues et gérées selon la loi sur la protection des animaux en Suisse et en conformité avec les règlements de l'office vétérinaire cantonal, Zurich. 1. Préparation de dissection Matériau, Culture Media, dispositifs microfluidiques Forceps autoclave micro-dissection et ciseaux (121 ° C, le temps de stérilisation: 20 min) et de les stocker dans un récipient stérile. Stériliser lamelles de verre (24 mm x 24 mm) en les incuban…

Representative Results

Ces résultats montrent que les ganglions trigéminés isolés peuvent se développer dans un compartiment du dispositif microfluidique et, en outre, que le développement des germes dentaires isolées est maintenue pendant une longue période de temps dans l'autre compartiment du dispositif microfluidique. Des milieux de culture différents sont utilisés dans les deux compartiments, et les micro-rainures entre les deux compartiments permettre l'extension de l'axone du ganglion trijumeau vers les germes den…

Discussion

Précédente dans des études in vitro de la dent innervation étaient basées sur des co-cultures conventionnelles de ganglions de Gasser et les tissus dentaires ou des cellules ^26,28,29. Ces études ont été menées pour étudier principalement les effets attractifs de ces cellules ou de tissus sur axones sensoriels ^38. Bien amener des avancées significatives dans le domaine, plusieurs questions techniques ont été soulevées. germes de dents commencent à dégénérer après…

Materials

AXIS Axon Isolation Devices	Millipore	AX15010-TC	Microchannels of different lenght are available
Laminin	Sigma Aldrich	L2020
Neurobasal	Gibco	21103-049
B27	Gibco	17504
Recombinant Mouse beta-NGF	R&D Systems	1156-NG-100	Human and Rat beta-NGF (R&D Systems) are equivalent
DMEM-F12	Gibco	11320-033