Die Analyse der Entwicklung von Zahnkeim Innervation Mit Microfluidic Co-Kultur-Geräte

Summary

Co-cultures represent a valuable method to study the interactions between nerves and target tissues and organs. Microfluidic systems allow co-culturing ganglia and whole developing organs or tissues in different culture media, thus representing a valuable tool for the in vitro study of the crosstalk between neurons and their targets.

Abstract

Innervation spielt eine Schlüsselrolle in der Entwicklung, Homöostase und Regeneration von Organen und Geweben. Allerdings sind die Mechanismen, die diese Phänomene sind nicht gut noch verstanden. Insbesondere wird die Rolle der Innervation in der Zahnentwicklung und Regeneration vernachlässigt.

Mehrere In-vivo-Studien haben wichtige Informationen über die Muster der Innervation der Zahngewebe während der Entwicklung und Reparaturprozesse von verschiedenen Tiermodellen zur Verfügung gestellt. Allerdings sind die meisten dieser Ansätze nicht optimal, um die molekulare Grundlage der Wechselwirkungen zwischen den Nervenfasern und die Zielorgane und Gewebe zu markieren.

Co-Kulturen stellen eine wertvolle Methode zu untersuchen und zu manipulieren, die Wechselwirkungen zwischen den Nervenfasern und die Zähne in einer kontrollierten und isolierten Umgebung. In den letzten Jahrzehnten haben sich herkömmliche Co-Kulturen unter Verwendung des gleichen Kulturmediums für sehr kurze Zeiträume durchgeführt wurden (beispielsweise zwei Tage)um die anziehende oder abstoßende Wirkung der Entwicklungs Mund- und Zahngewebe an sensorischen Nervenfasern zu untersuchen. Jedoch Verlängerung der Kultivierungsperiode erforderlich, um die Auswirkungen der Innervation auf Zahn Morphogenese und Zelldifferenzierung zu untersuchen.

Mikrofluidik-Systeme ermöglichen Co-Kulturen von Neuronen und verschiedene Zelltypen in ihren geeigneten Kulturmedien. Wir haben kürzlich gezeigt, dass Trigeminalganglien (TG) und die Zähne sind in der Lage, für eine lange Zeit überleben, wenn co-kultiviert in Mikrofluidvorrichtungen, und dass sie zu erhalten in diesen Bedingungen die gleiche Innervationsmuster, dass sie in vivo zeigen.

Auf dieser Basis beschreiben wir, wie zu isolieren und Co-Kultur entwickeln Trigeminalganglien und Zahnkeime in einem mikrofluidischen Co-Kultur system.This Protokoll beschreibt eine einfache und flexible Möglichkeit, Co-Kultur-Ganglien / Nerven und Zielgewebe und die Rollen zu studieren spezifischer Moleküle auf solchen Wechselwirkungen in einem controlled und isolierten Umgebung.

Introduction

Innervation spielt eine Schlüsselrolle in der Entwicklung, Homöostase und Regeneration von Organen und Geweben, ^{1,2. 5 –} Weiterhin ist Innervation bei der Regulation der Stammzellproliferation, Mobilisierung und Differenzierung ³ beteiligt. In der Tat, die jüngsten Studien in Geweben des orofazialen Komplexes realisiert haben gezeigt, dass parasympathischen Nerven sind für epithelialen Vorläuferzellen Funktion notwendig bei der Entwicklung und Regeneration der Speicheldrüsen ^6,7. Ebenso hat sich gezeigt, dass Innervation für die Entwicklung und Wartung von Gaumen ⁸ notwendig ^{– 11.} Somit ist es wichtig, die noch vernachlässigt Rollen Innervation bei der Entwicklung anderer wichtiger orofacial Organen und Geweben wie Zähne analysieren.

Trotz der Innervation reichen zweiten Zähne und im Gegensatz zu allen anderen Organen und Geweben des Körpers, developing Zähne beginnen, in den frühesten Stadien der postnatalen innerviert werden. Zähne entwickeln als Folge der sequentiellen und gegenseitige Wechselwirkungen zwischen oralen Ektoderm und Schädel Neuralleiste stammenden Mesenchym. Diese Wechselwirkungen führen zu Epithelzellen abgeleitete Adamantoblasten und Mesenchym abgeleitete Odontoblasten, die für die Bildung von Zahnschmelz und Dentin, die jeweils ¹² verantwortlich sind. Sensorischen Nerven vom Trigeminalganglien und sympathischen Nerven aus der oberen Halsganglien innervieren die Erwachsenen die Zähne ^13-15. Während der Embryogenese, Nervenfasern aus dem Trigeminalganglien Projekt gegenüber den Entwicklungszahnkeime ausgeht und progressiv umgeben sie aber nicht in die Papille Mesenchym ¹³ eindringen. Nervenfasern in das Zahnmark Mesenchym in fortgeschrittenen Entwicklungsstadien, die mit odontoblast Differenzierung und Dentin Matrixablagerung ¹⁶ zu korrelieren. Pulpa Innervation ist komplETED bald nach dem Zahndurchbruch in der Mundhöhle ^13. Frühere Studien haben gezeigt, dass verschiedene Semaphorine und Neurotrophine sind an der Regulation der Innervation bei Odontogenese ¹⁶ beteiligt ^{– 19.} Frühere Studien haben klar gezeigt, dass Innervation ist eine Voraussetzung für die Zahnbildung bei Fischen ^20. Neuere Studien haben gezeigt, daß die Homöostase der Zahn Mesenchym-Stammzellen in Maus-Schneidezähne wird durch sensorische Nerven über Sekretion von Sonic Hedgehog (Shh) ²¹ reguliert wird. Dennoch ist die Rolle der Innervation in Zahn Initiierung, Entwicklung und Regeneration immer noch sehr umstritten in Säugetieren ^22-24.

Eine Vielzahl von in-vivo-Studien haben wichtige Informationen über die Muster der Innervation der Zahngewebe während der Entwicklung und Reparaturprozesse von verschiedenen Tiermodellen ^13,25,26 vorgesehen. Jedoch sind die meisten von diesen auf angemesseneSchmerzen nicht optimal sind, um die molekularen Grundlagen der Wechselwirkungen zwischen Nervenfasern und Ziel Organe und Gewebe zu markieren. Co-Kulturen stellen eine wertvolle Methode zu untersuchen und zu manipulieren, die Wechselwirkungen zwischen den Nervenfasern und die Zähne in eine kontrollierte und isolierte Umgebung ^26-29. Zugleich ist Kokultivierung unterliegen verschiedenen technischen Anpassungen. Zum Beispiel, Nerven und spezifische Zahngewebe (zB Pulpa, Zahnsäckchen, Zahn Epithel) erfordern oft unterschiedliche Kulturmedien, um Gewebeüberlebenszeit für längere Zeit garantieren ^{30 – 32.}

In den letzten Jahrzehnten haben sich herkömmliche Co-Kulturen mit dem gleichen Kulturmedium für sehr kurze Zeiträume (zB zwei Tage) durchgeführt wurde, um die anziehende oder abstoßende Wirkung der Entwicklungs Mund- und Zahngewebe an sensorischen Nervenfasern ²⁷ zu untersuchen ^{– 29.}Jedoch Verlängerung der Kultivierungsperiode erforderlich, um die Auswirkungen der Innervation auf Zahn Morphogenese und Zelldifferenzierung zu untersuchen und die Dynamik von Nervenfasern innerhalb Verzweigungszielorgane zu untersuchen. Deshalb würde nicht zusammenhängende Co-Kulturen besser geeignet, um Studien über neuronale-Zahngewebe Interaktionen durchzuführen.

Mikrofluidik-Systeme ermöglichen Co-Kulturen von Neuronen und verschiedene Zelltypen in ihren geeigneten Kulturmedien. In diesen Vorrichtungen werden Zahngeweben und Neuronen in verschiedenen Kammern getrennt, während gleichzeitig das Wachstum der Axone der neuronalen Zellkörper durch Mikrokanäle in Richtung der Kammer ihre Zielgewebe ³³ enthält. Mikrofluidik-Vorrichtungen wurden bereits verwendet, um die Interaktionen zwischen Neuronen und Mikroglia ^34,35 sowie von Zelle zu Zelle-Wechselwirkungen bei Krebs und Neovaskularisation ³⁵ zu studieren. Darüber hinaus sind diese Systeme sind verwendet worden, um die Wechselwirkungen zwischen dors studierenal Wurzelganglien und Osteoblasten ^36.

Wir haben kürzlich gezeigt, dass trigeminalen Ganglien (TG) und der Zähne in der Lage sind, für längere Zeiträume zu überleben, wenn co-kultiviert in Mikrofluidik-Vorrichtungen ^37. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass die Zähne von verschiedenen Entwicklungsstadien zu erhalten in diesen in vitro Bedingungen die gleichen abstoßend oder anziehend Auswirkungen auf Trigeminus innerviert, dass sie in vivo ³⁷ zeigen. Dieses Protokoll enthält Informationen über eine einfache, leistungsfähige und flexible Möglichkeit, Co-Kultur-Ganglien / Nerven und Zielgewebe und die Rollen von spezifischen Molekülen auf solche Wechselwirkungen in einer kontrollierten und isolierten Umgebung zu studieren.

Protocol

Alle Mäuse wurden nach Schweizer Tierschutzgesetz und in Übereinstimmung mit den Vorschriften des kantonalen Veterinäramt, Zürich gepflegt und behandelt werden. 1. Herstellung von Dissection Material, Kultur, Medien, Mikrofluidiksysteme Autoklaven Mikrodissektion Pinzette und Schere (121 ° C, Sterilisationszeit: 20 min) und speichert sie in einem sterilen Behälter. Sterilisieren Deckgläser (24 mm x 24 mm) durch Inkubation in 1 M HCl 24 h lang auf einem Rundschütt…

Representative Results

Diese Ergebnisse zeigen, dass isolierte Trigeminalganglien kann in einem Abteil der mikrofluidischen Vorrichtung zu wachsen, und zusätzlich, dass die Entwicklung von den isolierten Zahnanlagen ist für einen langen Zeitraum in der anderen Kammer der mikrofluidischen Vorrichtung aufrechterhalten. Verschiedenen Kulturmedien sind in den zwei Kammern verwendet, und die Mikrorillen zwischen den beiden Kammern zu ermöglichen Verlängerung der Axone vom Ganglion trigeminale gegenüber den Entwicklungszahnanlagen dar….

Discussion

Vorherige in vitro-Studien der Zahn Innervation wurden auf herkömmliche Kokulturen Trigeminalganglien und Zahngewebe oder Zellen ^26,28,29 basiert. Diese Studien wurden durchgeführt, um in erster Linie untersuchen die attraktive Wirkung dieser Zellen oder Gewebe auf sensorische Axone ^38. Zwar bringen bedeutende Fortschritte auf dem Gebiet wurden mehrere technische Fragen aufgeworfen. Zahnkeime beginnen, nach ein paar Tagen der Kultur ³⁷ degenerieren. Basierend auf diesen Beobac…

Materials

AXIS Axon Isolation Devices	Millipore	AX15010-TC	Microchannels of different lenght are available
Laminin	Sigma Aldrich	L2020
Neurobasal	Gibco	21103-049
B27	Gibco	17504
Recombinant Mouse beta-NGF	R&D Systems	1156-NG-100	Human and Rat beta-NGF (R&D Systems) are equivalent
DMEM-F12	Gibco	11320-033