ניתוח של פיתוח שיניים נבט עצבוב שימוש בהתקני Microfluidic משותף התרבות

Summary

Co-cultures represent a valuable method to study the interactions between nerves and target tissues and organs. Microfluidic systems allow co-culturing ganglia and whole developing organs or tissues in different culture media, thus representing a valuable tool for the in vitro study of the crosstalk between neurons and their targets.

Abstract

עצבוב ממלא תפקיד מרכזי בפיתוח, הומאוסטזיס וההתחדשות של איברים ורקמות. עם זאת, מנגנוני תופעות אלה אינם מובנים היטב עדיין. בפרט, התפקיד של עצבוב בהתפתחות שן והתחדשות מוזנח.

כמה מחקרים בvivo סיפקו מידע חשוב על דפוסי העצבוב של רקמות שיניים במהלך תהליכי פיתוח ותיקון של מודלים של בעלי חיים שונים. עם זאת, רוב הגישות אלה אינם אופטימליים כדי להדגיש את הבסיס המולקולרי של יחסי הגומלין בין סיבי עצב ואברי מטרה ורקמות.

שיתוף תרבויות מהוות שיטת ערך לחקור ולטפל האינטראקציות בין סיבי עצב ושיניים בסביבה מבוקרת ומבודדת. בעשורים האחרונים, שיתוף תרבויות קונבנציונליות תוך שימוש באותו מדיום התרבות בוצעו לתקופות קצרות מאוד (למשל, שני ימים)כדי לחקור את ההשפעות אטרקטיביות או דוחות של פיתוח רקמות פה והשיניים בסיבי עצב תחושתיים. עם זאת, הארכת תקופת התרבות נדרש כדי לחקור את ההשפעות של עצבוב בהמורפוגנזה השן וcytodifferentiation.

מערכות מיקרופלואידיקה לאפשר שיתוף תרבויות של תאי עצב ותאים מסוגים שונים בתקשורת והתרבות המתאימה. אנחנו הוכחנו לאחרונה כי הגרעינים המשולש (TG) ושיניים יכולים לשרוד במשך תקופה ארוכה של זמן, כאשר שיתוף תרבותי במכשירי microfluidic, וכי הם שומרים בתנאים אלה את אותו דפוס העצבוב שהם מראים בvivo.

על בסיס זה, אנו מתארים כיצד לבודד ושיתוף התרבות מתפתחת חיידקי הגרעינים ושן המשולש בפרוטוקול system.This שיתוף תרבות microfluidic מתארת ​​בצורה פשוטה וגמישה גרעיני לתרבות משותפת / עצבים ורקמות יעד וללמוד את התפקידים של מולקולות ספציפיות על אינטראקציות כאלה בcontrolled וסביבה מבודדת.

Introduction

עצבוב ממלא תפקיד מרכזי בפיתוח, הומאוסטזיס וההתחדשות של איברים ורקמות ^1,2. יתר על כן, עצבוב מעורב בוויסות של התפשטות תאי גזע, גיוס ובידול ^3-5. ואכן, מחקרים שנעשה לאחרונה הבינו ברקמות של המתחם orofacial הראו כי עצבים הפאראסימפתטית נחוצים לתפקוד תאי אפיתל בפיתוח וההתחדשות של בלוטות הרוק ^6,7. באופן דומה, זה כבר הוכיח כי העצבוב הוא הכרחי לפיתוח והתחזוקה של בלוטות טעם ^8-11. לפיכך, חשוב לנתח את התפקידים עדיין המוזנחים של עצבוב בפיתוח איברים אחרים חשובים orofacial ורקמות כגון שיניים.

למרות העצבוב העשיר של שיניים למבוגרים, וזאת בניגוד לכל איברים ורקמות האחרים בגוף, develoשיני פינג מתחילות להיות מעוצבבים בשלבי הלידה המוקדמים. שיניים להתפתח כתוצאה מאינטראקציות רציפות והדדית בין האאקטודרם האוראלי וmesenchyme נגזר רכס העצבי גולגולתי. אינטראקציות אלה להצמיח ameloblasts נגזר אפיתל וodontoblasts נגזר mesenchyme שאחראי להיווצרות של אמייל והדנטין, בהתאמה ^12. עצבים תחושתיים מהגרעינים המשולש ועצבים סימפטיים מגרעיני צוואר רחם מעולים מעצבבים את השיניים למבוגרים ^13-15. במהלך עובר, סיבי עצב הנובעים מפרויקט הגרעינים המשולש כלפי חיידקי שן פיתוח ומקיפים אותם בהדרגה, אבל הם לא לחדור לתוך mesenchyme papilla השיניים ^13. סיבי עצב להיכנס mesenchyme עיסת השיניים בשלבי התפתחות מתקדמים יותר המתואמים עם בידול odontoblast ומטריצת דנטין תצהיר ^16. עצבוב עיסת שיניים הוא completed זמן קצר לאחר בקיעת השן בחלל הפה ^13. מחקרים קודמים גילו כי semaphorins וneurotrophins השונים מעורבים בוויסות של עצבוב בodontogenesis ^16-19. המחקרים קודמים הראו כי באופן ברור עצבוב הוא תנאי הכרחי להיווצרות שן בדגים ^20. מחקרים מאוחרים יותר הראו שהומאוסטזיס של תאי גזע mesenchyme שיניים בשיניים חותכות עכבר מוסדר על ידי עצבים תחושתיים באמצעות הפרשה של קיפוד הקולי (ששש) ^21. עם זאת, התפקיד של עצבוב בשן ייזום, פיתוח והתחדשות הוא עדיין שנוי במחלוקת ביונקים ^22-24.

שפע של מחקרי in vivo סיפק מידע חשוב על דפוסי העצבוב של רקמות שיניים במהלך תהליכי פיתוח ותיקון של מודלים של בעלי חיים שונים ^13,25,26. עם זאת, רוב אלה approכאבים אינם אופטימליים כדי להדגיש את הבסיס המולקולרי של יחסי הגומלין בין סיבי עצב ואברי מטרה ורקמות. שיתוף תרבויות מהוות שיטת ערך לחקור ולטפל האינטראקציות בין סיבי עצב ושיניים בסביבה מבוקרת ומבודדת ^26-29. במקביל, שיתוף culturing כפוף להתאמות טכניות שונות. לדוגמא, עצבים ורקמות ספציפיות שיניים (לדוגמא, עיסת שיניים, זקיק שיניים, השיניים אפיתל) לעתים קרובות דורש תקשורת ותרבות שונה על מנת להבטיח את הישרדות רקמה לפרקי זמן ארוך ^{30 – 32.}

בעשורים האחרונים, שיתוף תרבויות קונבנציונליות תוך שימוש באותו מדיום התרבות בוצעו לתקופות קצרות מאוד (למשל, שני ימים) כדי לחקור את ההשפעות אטרקטיביות או דוחות של פיתוח רקמות פה והשיניים בסיבי עצב תחושתי ^27-29.עם זאת, הארכת תקופת התרבות נדרש כדי לחקור את ההשפעות של עצבוב בהמורפוגנזה השן וcytodifferentiation, וללמוד את הדינמיקה של סיבי עצב הסתעפות בתוך אברי מטרה. לכן, שיתוף תרבויות בלתי רציפה תהיה יותר מתאימות לביצוע מחקרים על אינטראקציות רקמות עצביות-שיניים.

מערכות מיקרופלואידיקה לאפשר שיתוף תרבויות של תאי עצב ותאים מסוגים שונים בתקשורת והתרבות המתאימה. במכשירים אלה, רקמות ותאי עצב שיניים מופרדות בתאים שונים, תוך מתן אפשרות לצמיחה של אקסונים מהגופים התא העצביים דרך microchannels כלפי התא המכיל רקמות היעד שלהם ^33. מכשירי microfluidic כבר נעשו שימוש כדי ללמוד את יחסי הגומלין בין תאי עצב והמיקרוגלים ^34,35, כמו גם תא לתא אינטראקציות בסרטן וneovascularization ^35. יתר על כן, מערכות אלה היו בשימוש כדי לחקור את יחסי הגומלין בין Dorsגרעיני אל שורש וosteoblasts ^36.

אנחנו הוכחנו לאחרונה כי הגרעינים המשולש (TG) ושיניים יכולים לשרוד במשך תקופות זמן ארוכות כאשר שיתוף תרבותי במכשירי microfluidic ^37. יתר על כן, יש לנו הראינו ששיניים משלבי התפתחות שונים לשמור במבחנה בתנאים אלה את אותו האפקט דוחה או מושך על עצבוב המשולש שהם מראים בvivo ^37. פרוטוקול זה מספק מידע על דרך פשוטה, חזקה וגמישה גרעיני לתרבות משותפת / עצבים ורקמות יעד וללמוד את התפקידים של מולקולות ספציפיות על כגון אינטראקציות בסביבה מבוקרת ומבודדת.

Protocol

כל העכברים נשמרו וטופלו על פי חוק צער בעלי החיים השוויצרי ובהתאם לתקנות של משרד הקנטון הווטרינרית, ציריך. 1. הכנת Dissection חומר, תרבות מדיה, המכשירים microfluidic מלקחיים החיטוי מיקרו לנתיח…

Representative Results

תוצאות אלו מראות כי הגרעינים המשולש מבודדים יכולים לגדול בתא אחד של מכשיר microfluidic ו, בנוסף, כי הפיתוח של חיידקי שן הבודדים מתמשך לתקופה ארוכה של זמן בתא האחר של מכשיר microfluidic. תקשורת והתרבות שונה משמשות בשני תאים, וmicrogrooves בין שני התאים לאפשר הרחבה של האקסון מגנגליון trigem…

Discussion

קודם בניסויים במבחנה של עצבוב שן היו מבוסס על שיתוף תרבויות קונבנציונליות של הגרעינים המשולש ורקמות או תאים ^26,28,29 שיניים. מחקרים אלה נערכו לחקור בעיקר את ההשפעות אטרקטיביות של תאים או רקמות אלה באקסונים חושיים ^38. למרות שמביא התקדמות משמעותית בתחום, כ…

Materials

AXIS Axon Isolation Devices	Millipore	AX15010-TC	Microchannels of different lenght are available
Laminin	Sigma Aldrich	L2020
Neurobasal	Gibco	21103-049
B27	Gibco	17504
Recombinant Mouse beta-NGF	R&D Systems	1156-NG-100	Human and Rat beta-NGF (R&D Systems) are equivalent
DMEM-F12	Gibco	11320-033