Co-cultures represent a valuable method to study the interactions between nerves and target tissues and organs. Microfluidic systems allow co-culturing ganglia and whole developing organs or tissues in different culture media, thus representing a valuable tool for the in vitro study of the crosstalk between neurons and their targets.
עצבוב ממלא תפקיד מרכזי בפיתוח, הומאוסטזיס וההתחדשות של איברים ורקמות. עם זאת, מנגנוני תופעות אלה אינם מובנים היטב עדיין. בפרט, התפקיד של עצבוב בהתפתחות שן והתחדשות מוזנח.
כמה מחקרים בvivo סיפקו מידע חשוב על דפוסי העצבוב של רקמות שיניים במהלך תהליכי פיתוח ותיקון של מודלים של בעלי חיים שונים. עם זאת, רוב הגישות אלה אינם אופטימליים כדי להדגיש את הבסיס המולקולרי של יחסי הגומלין בין סיבי עצב ואברי מטרה ורקמות.
שיתוף תרבויות מהוות שיטת ערך לחקור ולטפל האינטראקציות בין סיבי עצב ושיניים בסביבה מבוקרת ומבודדת. בעשורים האחרונים, שיתוף תרבויות קונבנציונליות תוך שימוש באותו מדיום התרבות בוצעו לתקופות קצרות מאוד (למשל, שני ימים)כדי לחקור את ההשפעות אטרקטיביות או דוחות של פיתוח רקמות פה והשיניים בסיבי עצב תחושתיים. עם זאת, הארכת תקופת התרבות נדרש כדי לחקור את ההשפעות של עצבוב בהמורפוגנזה השן וcytodifferentiation.
מערכות מיקרופלואידיקה לאפשר שיתוף תרבויות של תאי עצב ותאים מסוגים שונים בתקשורת והתרבות המתאימה. אנחנו הוכחנו לאחרונה כי הגרעינים המשולש (TG) ושיניים יכולים לשרוד במשך תקופה ארוכה של זמן, כאשר שיתוף תרבותי במכשירי microfluidic, וכי הם שומרים בתנאים אלה את אותו דפוס העצבוב שהם מראים בvivo.
על בסיס זה, אנו מתארים כיצד לבודד ושיתוף התרבות מתפתחת חיידקי הגרעינים ושן המשולש בפרוטוקול system.This שיתוף תרבות microfluidic מתארת בצורה פשוטה וגמישה גרעיני לתרבות משותפת / עצבים ורקמות יעד וללמוד את התפקידים של מולקולות ספציפיות על אינטראקציות כאלה בcontrolled וסביבה מבודדת.
עצבוב ממלא תפקיד מרכזי בפיתוח, הומאוסטזיס וההתחדשות של איברים ורקמות 1,2. יתר על כן, עצבוב מעורב בוויסות של התפשטות תאי גזע, גיוס ובידול 3-5. ואכן, מחקרים שנעשה לאחרונה הבינו ברקמות של המתחם orofacial הראו כי עצבים הפאראסימפתטית נחוצים לתפקוד תאי אפיתל בפיתוח וההתחדשות של בלוטות הרוק 6,7. באופן דומה, זה כבר הוכיח כי העצבוב הוא הכרחי לפיתוח והתחזוקה של בלוטות טעם 8-11. לפיכך, חשוב לנתח את התפקידים עדיין המוזנחים של עצבוב בפיתוח איברים אחרים חשובים orofacial ורקמות כגון שיניים.
למרות העצבוב העשיר של שיניים למבוגרים, וזאת בניגוד לכל איברים ורקמות האחרים בגוף, develoשיני פינג מתחילות להיות מעוצבבים בשלבי הלידה המוקדמים. שיניים להתפתח כתוצאה מאינטראקציות רציפות והדדית בין האאקטודרם האוראלי וmesenchyme נגזר רכס העצבי גולגולתי. אינטראקציות אלה להצמיח ameloblasts נגזר אפיתל וodontoblasts נגזר mesenchyme שאחראי להיווצרות של אמייל והדנטין, בהתאמה 12. עצבים תחושתיים מהגרעינים המשולש ועצבים סימפטיים מגרעיני צוואר רחם מעולים מעצבבים את השיניים למבוגרים 13-15. במהלך עובר, סיבי עצב הנובעים מפרויקט הגרעינים המשולש כלפי חיידקי שן פיתוח ומקיפים אותם בהדרגה, אבל הם לא לחדור לתוך mesenchyme papilla השיניים 13. סיבי עצב להיכנס mesenchyme עיסת השיניים בשלבי התפתחות מתקדמים יותר המתואמים עם בידול odontoblast ומטריצת דנטין תצהיר 16. עצבוב עיסת שיניים הוא completed זמן קצר לאחר בקיעת השן בחלל הפה 13. מחקרים קודמים גילו כי semaphorins וneurotrophins השונים מעורבים בוויסות של עצבוב בodontogenesis 16-19. המחקרים קודמים הראו כי באופן ברור עצבוב הוא תנאי הכרחי להיווצרות שן בדגים 20. מחקרים מאוחרים יותר הראו שהומאוסטזיס של תאי גזע mesenchyme שיניים בשיניים חותכות עכבר מוסדר על ידי עצבים תחושתיים באמצעות הפרשה של קיפוד הקולי (ששש) 21. עם זאת, התפקיד של עצבוב בשן ייזום, פיתוח והתחדשות הוא עדיין שנוי במחלוקת ביונקים 22-24.
שפע של מחקרי in vivo סיפק מידע חשוב על דפוסי העצבוב של רקמות שיניים במהלך תהליכי פיתוח ותיקון של מודלים של בעלי חיים שונים 13,25,26. עם זאת, רוב אלה approכאבים אינם אופטימליים כדי להדגיש את הבסיס המולקולרי של יחסי הגומלין בין סיבי עצב ואברי מטרה ורקמות. שיתוף תרבויות מהוות שיטת ערך לחקור ולטפל האינטראקציות בין סיבי עצב ושיניים בסביבה מבוקרת ומבודדת 26-29. במקביל, שיתוף culturing כפוף להתאמות טכניות שונות. לדוגמא, עצבים ורקמות ספציפיות שיניים (לדוגמא, עיסת שיניים, זקיק שיניים, השיניים אפיתל) לעתים קרובות דורש תקשורת ותרבות שונה על מנת להבטיח את הישרדות רקמה לפרקי זמן ארוך 30 – 32.
בעשורים האחרונים, שיתוף תרבויות קונבנציונליות תוך שימוש באותו מדיום התרבות בוצעו לתקופות קצרות מאוד (למשל, שני ימים) כדי לחקור את ההשפעות אטרקטיביות או דוחות של פיתוח רקמות פה והשיניים בסיבי עצב תחושתי 27-29.עם זאת, הארכת תקופת התרבות נדרש כדי לחקור את ההשפעות של עצבוב בהמורפוגנזה השן וcytodifferentiation, וללמוד את הדינמיקה של סיבי עצב הסתעפות בתוך אברי מטרה. לכן, שיתוף תרבויות בלתי רציפה תהיה יותר מתאימות לביצוע מחקרים על אינטראקציות רקמות עצביות-שיניים.
מערכות מיקרופלואידיקה לאפשר שיתוף תרבויות של תאי עצב ותאים מסוגים שונים בתקשורת והתרבות המתאימה. במכשירים אלה, רקמות ותאי עצב שיניים מופרדות בתאים שונים, תוך מתן אפשרות לצמיחה של אקסונים מהגופים התא העצביים דרך microchannels כלפי התא המכיל רקמות היעד שלהם 33. מכשירי microfluidic כבר נעשו שימוש כדי ללמוד את יחסי הגומלין בין תאי עצב והמיקרוגלים 34,35, כמו גם תא לתא אינטראקציות בסרטן וneovascularization 35. יתר על כן, מערכות אלה היו בשימוש כדי לחקור את יחסי הגומלין בין Dorsגרעיני אל שורש וosteoblasts 36.
אנחנו הוכחנו לאחרונה כי הגרעינים המשולש (TG) ושיניים יכולים לשרוד במשך תקופות זמן ארוכות כאשר שיתוף תרבותי במכשירי microfluidic 37. יתר על כן, יש לנו הראינו ששיניים משלבי התפתחות שונים לשמור במבחנה בתנאים אלה את אותו האפקט דוחה או מושך על עצבוב המשולש שהם מראים בvivo 37. פרוטוקול זה מספק מידע על דרך פשוטה, חזקה וגמישה גרעיני לתרבות משותפת / עצבים ורקמות יעד וללמוד את התפקידים של מולקולות ספציפיות על כגון אינטראקציות בסביבה מבוקרת ומבודדת.
קודם בניסויים במבחנה של עצבוב שן היו מבוסס על שיתוף תרבויות קונבנציונליות של הגרעינים המשולש ורקמות או תאים 26,28,29 שיניים. מחקרים אלה נערכו לחקור בעיקר את ההשפעות אטרקטיביות של תאים או רקמות אלה באקסונים חושיים 38. למרות שמביא התקדמות משמעותית בתחום, כ…
The authors have nothing to disclose.
The work was funded by the University of Zurich. The authors would like to thank Estrela Neto and Dr. Meriem Lamghari for helping in establishing the co-culture conditions.
AXIS Axon Isolation Devices | Millipore | AX15010-TC | Microchannels of different lenght are available |
Laminin | Sigma Aldrich | L2020 | |
Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
B27 | Gibco | 17504 | |
Recombinant Mouse beta-NGF | R&D Systems | 1156-NG-100 | Human and Rat beta-NGF (R&D Systems) are equivalent |
DMEM-F12 | Gibco | 11320-033 |