Le reti neurali ricalcolate anatomicamente tridimensionali dei micro-tessuti per la ricostruzione, la modulazione e la modellazione del sistema nervoso

Summary

Questo manoscritto specifica la realizzazione di reti neurali rivelate micro-tessuto: costruzioni tridimensionali di dimensioni microniche costituite da tratti longitudinali allineati allineati che comprendono la popolazione neuronale aggregata racchiuse in un idrogel tubolare. Questi impalcature viventi possono servire come relè funzionali per ricostruire o modulare la circuiteria neurale o come test-letti biofidelici che imitano la neuroanatomia della materia grigio-bianca.

Abstract

Il recupero funzionale si verifica raramente dopo lesioni o degenerazioni causate da malattie all'interno del sistema nervoso centrale (CNS) a causa dell'ambiente inibitorio e della limitata capacità di neurogenesi. Stiamo sviluppando una strategia per affrontare simultaneamente la perdita di percorso neuronale e axon all'interno del CNS danneggiato. Questo manuale presenta il protocollo di fabbricazione per reti neurali (micro-TENN) progettate da micro-tessuti, costruzioni impiantabili costituiti da neuroni e tratti assonali allineati che attraversano il lumen di matrice extracellulare (ECM) di un cilindro idrogelizzato preformato centinaia di micron di diametro che può estendere centimetri in lunghezza. Gli aggregati neuronali sono delimitati agli estremi dell'incasso tridimensionale e sono allineati da proiezioni assonali. Le micro-TENN sono in una posizione unica come strategia per la ricostruzione del CNS, che emulano aspetti della cytoarchitettura del connettore del cervello e potenzialmente forniscono mezzi per la sostituzione della rete. Il neuGli aggregati ronalmente possono sinaptare con il tessuto ospite per formare nuovi relè funzionali per ripristinare e / o modulare i circuiti mancanti o danneggiati. Questi costrutti possono anche agire come "scaffolds viventi" pro-rigenerativi capaci di sfruttare meccanismi di sviluppo per la migrazione cellulare e la percorrenza axonale, fornendo segnali strutturali e solubili sinergici basati sullo stato di rigenerazione. Le micro-TENN sono fabbricate versando idrogel liquido in uno stampo cilindrico contenente un ago centrato longitudinalmente. Una volta che l'idrogelo ha gellato, l'ago viene rimosso, lasciando una micro-colonna vuota. Una soluzione ECM viene aggiunta al lumen per fornire un ambiente adatto per l'adesione neuronale e l'espansione assonica. I neuroni dissociati vengono aggregati meccanicamente per una precisa semina all'interno di una o entrambe le estremità della micro-colonna. Questa metodologia crea in modo affidabile i costrutti miniaturizzati indipendenti con tratti assonali prolungati che possono ricapitolare le caratteristiche della neuroanatomia cerebrale. Synaptic immGli indicatori di calcio non codificati e codificati geneticamente suggeriscono che le micro-TENN posseggano un'ampia distribuzione sinaptica e un'attività elettrica intrinseca. Di conseguenza, le micro-TENN rappresentano una strategia promettente per la ricostruzione neurochirurgica mirata dei percorsi cerebrali e possono anche essere applicati come modelli biofidelici per studiare i fenomeni neurobiologici in vitro .

Introduction

Una caratteristica comune dei disturbi e delle malattie del sistema nervoso centrale (CNS) come la lesione traumatica del cervello (TBI), lesioni del midollo spinale (SCI), ictus, malattia di Alzheimer e la malattia di Parkinson è la disconnessione dei percorsi assonali e delle cellule neuronali Perdita ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6} . Ad esempio, quando un colpo ischemico non viene trattato, si stima che gli assoni siano persi a una velocità di 7 miglia di assoni al minuto ⁵ . Nel caso di TBI, che circa 1,7 milioni di persone sperimentano ogni anno negli Stati Uniti, la degenerazione assonale può continuare a verificarsi anni dopo il trauma, in quanto il pregiudizio iniziale precipita uno stato neurodegenerativo a lungo termine ⁴ . Aggravatando questi effetti deleteri, il CNS ha una capacità fortemente limitataCittà per la rigenerazione ^{1 , 7 , 8 , 9} . Dopo la lesione, si sviluppa un ambiente inibitorio caratterizzato da una mancanza di guida diretta a bersagli distanti, nella presenza di inibitori associati alla mielina che ostacolano la crescita del neurite e la formazione di una cicatrice gliale mediante astrociti reattivi ^{8 , 10 , 11 , 12} . La cicatrice gliale serve come barriera biochimica e fisica alla rigenerazione, con molecole come proteoglicani di condroitina solfato che ostruiscono la crescita dell'assone ^{8 , 11} . Inoltre, anche se le cellule staminali neurali sono state trovate nel CNS adulto, la produzione di nuovi neuroni è limitata, in quanto una prova consistente di neurogenesi è stata trovata solo nel bulbo olfattivo, l'ippocampoZona subgranulare, zona periventricolare e canale centrale del midollo spinale ^{13 , 14} . Questi ostacoli impediscono il recupero funzionale dei neuroni perduti e dell'architettura della materia bianca dopo lesioni o malattie, con conseguente effetto spesso alterato e prolungato di queste condizioni.

Nonostante la mancanza di capacità rigenerativa nel CNS adulte, è stato dimostrato che la rigenerazione assonale è possibile se vengono presentati adeguati suggerimenti ambientali ai neuroni ospiti ^{15 , 16 , 17 , 18} . I ricercatori hanno cercato di trasportare e manipolare fattori di crescita ( ad esempio, fattore di crescita del nervo, fattore di crescita epidermico, fattore di crescita dipendente dagli ialti e fattore neurotrofico 3) e altre molecole di guida per stimolare la plasticità e la rigenerazione dell'assone ^{14 ,}/ Sup> ^{18 , 19} . Anche se questi studi hanno confermato che gli assoni adulti sono in grado di rispondere ai fattori di crescita, queste strategie sono limitate dalla bassa permeabilità della barriera emato-sangue e dalle specifiche sfumature spaziali e temporali necessarie per promuovere la rigenerazione ^{14 , 18 e 19} . Altri approcci hanno affidato l'iperattivazione dei fattori di trascrizione correlati alla rigenerazione nei neuroni del CNS. Ad esempio, la sovraespressione del fattore di trascrizione Stat3 stimola la rigenerazione assonale nel nervo ottico ²⁰ . Tuttavia, sia la consegna della biomolecola che la sovraespressione dei fattori di trascrizione non riescono a sostituire le popolazioni neuronali perse. Le strategie cellulari sono state principalmente incentrate sul trapianto di cellule staminali neurali (NSC) nel CNS, sfruttando la loro capacità di sostituire i neuroni CNS, rilasciare fattori trofici,E sostenere i tentativi di neurogenesi che si verificano dopo lesioni ¹⁷ . Nonostante ciò, ci sono ancora pressanti sfide che ostacolano questo approccio, compresa la capacità ostacolata delle cellule neurali trapiantate per sopravvivere, integrarsi con l'ospite e rimanere spazialmente limitati all'area ferita ^{6 , 14 , 17 , 21} . Inoltre, la sola consegna cellulare non è in grado di reintegrare la citoarchitettura di percorsi axonal danneggiati o persi. Un approccio alternativo che affronta i problemi che si trovano ad affrontare le strategie di consegna di cellule e droga / chimica sta combinando questi approcci con l'uso dei biomateriali ^{14 , 22 , 23} . I biomateriali come gli idrogeli sono in grado di emulare le proprietà biochimiche e fisiche della matrice extracellulare (ECM), aiutando la distribuzione cellulare eD all'interno dell'area ferita e fornendo fattori di crescita e altre molecole bioattive con rilascio controllato ²² . Le caratteristiche interessanti di queste strategie basate su biomateriali hanno portato alla prova della rigenerazione assonica in vivo dopo il trapianto di scaffolds alla zona lesionata ^{24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30} . Tuttavia, le strategie biomateriali acellulari non sostituiscono le popolazioni neuronali perse; Quando vengono utilizzati come veicoli di erogazione per cellule precursori neuronali, gliali o neuronali, i biomateriali non sono in grado di ricostituire reti assonali a lunga distanza. La sfida di sviluppare un approccio che affronta sia la degenerazione del percorso assonale che la perdita neuronale associati a lesioni e malattie del CNS rimangono ancora <Sup class = "xref"> 31.

Il nostro gruppo di ricerca ha riportato in precedenza lo sviluppo di reti neurali (micro-TENN), progettate da micropagnetismi impiantabili, che sono un tipo di "scaffold vivente" costituito da corpi cellulari neuronali limitati a una o entrambe le estremità di una micro-colonna idrogel-ECM agarosio , Con tratti assonali allineati in tutto l'interno di questo incasso tridimensionale (3D) ^{1 , 10 , 31 , 32} . Una delle principali differenze tra questa tecnica e gli approcci precedenti è che la citoarchitettura delle micro-TENNs è stata completamente creata in vitro e viene poi trapiantato dopo ^{33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 ,}Sup class = "xref"> 39 ^{, 40 , 41} . La fabbricazione in vitro offre un ampio controllo spaziale e temporale del fenotipo cellulare e dell'orientamento, delle proprietà meccaniche / fisiche, dei segnali biochimici e dei fattori esogeni, che beneficiano dell'integrazione di questi scaffolds con l'ospite dopo l'impianto ^{41 , 42} . Le micro-TENN sono ispirate anatomicamente perché emulano la neuroanatomia del cervello, mostrando tracce assonali simili a quelle che ponte le distinte aree funzionali del cervello ( Figura 1A ) ¹ . Pertanto, questa strategia potrebbe essere in grado di sostituire fisicamente i tratti di tessuti bianchi persi e neuroni dopo l'impianto in una regione lesionata. Questa tecnica è ispirata anche da meccanismi di sviluppo in cui "scaffolds viventi naturali" formati da cellule gliali radiali e assoni pionieristici agiscono come guide di percorrenza per celluleMigrazione dalla zona subventricolare e outgrowth axon, rispettivamente ⁴³ . Questi meccanismi sono ricapitolati nei tratti assonali allineati di micro-TENN, che possono presentare percorsi di vita per la migrazione delle cellule neurali e la rigenerazione assonale mediante una crescita assonale mediata dall'assone ( Figura 1C ) ⁴³ . Inoltre, questa strategia sfrutta l'integrazione sinaptica tra i neuroni micro-TENN e il circuito nativo, formando nuovi relè che possono contribuire al recupero funzionale ( Figura 1B ) ⁴³ . La capacità di formazione di sinapsi può anche concedere a questo approccio la capacità di modulare il CNS e di rispondere al tessuto dell'ospite in base ai feedback di rete. Ad esempio, i neuroni ottogeneticamente attivi nei montanti viventi possono essere stimolati per modulare i neuroni dell'ospite attraverso interazioni sinaptiche ( Figura 1D ).

Inoltre, il costruttore tubolare a base biomaterialeLa presenza di micro-TENN offre un ambiente adeguato per l'adesione, la crescita, l'estensione del neurite e la segnalazione delle cellule, mentre le dimensioni in miniatura dei costrutti potenzialmente consentono l'impianto minima invasivo e forniscono un microambiente parzialmente sequestrato per una graduale integrazione nel cervello. Infatti, le pubblicazioni recenti hanno dimostrato il potenziale delle micro-TENN per imitare i percorsi neurali dopo l'impianto nel cervello del topo. A seguito di microinjection stereotassiale, abbiamo precedentemente riportato prove di sopravvivenza neuronale micro-TENN, mantenimento dell'architettura del tratto assonale e estensione del neurite nella corteccia ospite per almeno 1 mese in vivo ^{10 , 31} . Inoltre, l'etichettatura con la sinapsina ha fornito prove istologiche dell'integrazione sinaptica con il tessuto nativo ^{10 , 31} . Nel complesso, le micro-TENN possono essere particolarmente adattate per ricostruire e modulare danniCNS sostituendo i neuroni perduti, integrando sinapticamente con il circuito ospite, ripristinando la citoarchitettura assonale persa e, in alcuni casi, fornendo assoni rigeneranti con gli opportuni segnali di percorrenza.

Figura 1: Principi e ispirazione dietro lo sviluppo di reti neurali innovative (micro-TENN). ( A ) Le micro-TENN simulano la citoarchitettura del connettore del cervello (viola), in cui regioni funzionalmente distinte sono collegate da tratti assonali lunghi e allineati in modo unidirezionale (rosso, verde) o bidirezionale (blu). Come esempio, le micro-TENN potrebbero ricostituire le connessioni perse in percorsi corticotalamici e nigrostriatali o nel percorso perforante dalla corteccia entorilina all'ippocampo (adattato da Struzyna et al. , 2015) ¹ . ( B ) Diagramma di una unidirezioneL e bidimensionale micro-TENN (rosso e blu) sinapticamente integranti con il circuito ospite (viola) per servire come relè funzionale tra le due estremità di una lesione. ( C ) Schema dei tratti assonali di un micro-TENN unidirezionale (verde) che funge da guida per la rigenerazione degli assoni ospitanti (viola) facilitati dall'assone verso un obiettivo con cui il micro-TENN interagisce. ( D ) Schema concettuale dell'utilizzo di micro-TENNS attivo-otticamente attivi come neuromodulatori, sfruttando l'integrazione sinaptica con neuroni eccitatori o inibitori (in basso). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L'attuale manoscritto illustra la metodologia utilizzata per la realizzazione di micro-TENN utilizzando i neuroni corticali cerebrali embrionati. In particolare, le micro-TENN potrebbero essere fabbricate con altri tipi di cellule neurali. Per esAmpiamente, i primi rapporti di sviluppo micro-TENN di successo hanno caratterizzato i neuroni del ganglio radicale dorsale (DRG) ³² . Le micro-colonne idrogel possono essere generate ( Figura 2A ) aggiungendo agarosio liquido ad una matrice cilindrica a taglio laser su misura oa tubi capillari, entrambi contenenti aghi allineati di agopuntura. L'ago forma il lumen e determina il diametro interno (ID) della micro-colonna, mentre l'ID tubo capillare e il diametro dei cilindri nel dispositivo taglio laser dettano il diametro esterno (OD) dei costrutti. L'OD e l'ID possono essere scelti in base all'applicazione desiderata selezionando diametri differenti per i tubi del dispositivo / capillare e gli aghi di agopuntura rispettivamente. La lunghezza delle micro-colonne può anche essere variata; Ad oggi, abbiamo riportato la costruzione di micro-TENN fino a 20 mm di lunghezza ¹⁰ e perseguono attivamente lunghezze ancora più lunghe. Dopo i gel agarosici e l'agopuntura nLe eedle vengono rimosse, una soluzione ECM generalmente costituita da collagene di tipo I e laminina viene aggiunta al lumen dei costrutti ( figura 2C ). Il nucleo ECM fornisce un ponteggio per supportare l'adesione delle cellule neuronali e l'espansione assonica. Inizialmente i neuroni corticali primari del ratto venivano placcati nelle micro-colonne utilizzando sospensioni cellulari dissociate ^{10 , 31 , 32} . Tuttavia, questo approccio non ha prodotto la citoarchitettura target in tutti i casi, definita come i corpi delle cellule neuronali limitati alle estremità delle micro-colonne, con il lumen centrale costituito da tratti assonali puri allineati. Da allora, l'uso di un metodo di aggregazione neuronale forzata (basato su protocolli adattati da Ungrin e altri ) ha permesso una più affidabile e coerente fabbricazione di micro-TENNs con la struttura ideale ( figura 2B ) ⁴⁴ . Oltre a descrivere la correnteMetodo, questo articolo mostrerà rappresentativi di fase-fase e immagini confocali di micro-TENN che dimostrano la formazione di tratti assonali nel tempo, così come la citoarchitettura finalizzata. Questo manoscritto si espanderà anche sugli aspetti degni di nota del protocollo e sulle sfide e sulle future direzioni della tecnologia micro-TENN.

Figura 2: Diagramma schema del processo di fabbricazione micro-TENN a tre stadi. ( A ) Sviluppo dell'idrogel agarosico: (i) Inizialmente, un piccolo aghi di agopuntura ( ad esempio , diametro di 180-350 μm) viene inserito nei canali cilindrici di uno stampo a taglio laser su misura o di un capillare ( ad es. , Diametro 380-700 μm). Nella fase successiva, l'agarosio liquido in DPBS viene introdotto nei canali cilindrici o nei tubi capillari. (Ii) Dopo i gel di agarosio, l 'ago viene rimosso eLo stampo viene smontato per produrre le micro-colonne cave agarose. (Iii) Questi costrutti vengono poi sterilizzati e memorizzati in DPBS. ( B ) La cultura neuronale primaria e il metodo aggregato: (i) L'aggregazione neuronale viene eseguita in matrici di micro-pozzi piramidali, stampate da stampi stampati in 3D, che si inseriscono nei pozzetti di una piastra di coltura a 12 pozzetti. (Ii) Le micro-TENN includono i neuroni primari di ratto dissociati dai cervelli fetali dei ratti embrionali-giorno-18. Dopo la dissociazione tissutale con trypsina-EDTA e DNasi I, viene preparata una soluzione cellulare di densità 1,0-2,0 x 106 cellule / mL. Iii) 12 μL di questa soluzione vengono trasferiti a ciascun pozzetto nella matrice piramidale a micro-pozzetto. La piastra contenente questi micro-pozzetti viene centrifugata per produrre aggregati cellulari. (Iv) Questi vengono quindi incubati durante la notte prima della placcatura nelle micro-colonne. ( C ) Fabbricazione del nucleo ECM e sementi cellulari: (i) Prima della semina cellulare, una soluzione ECM contenente 1 mg / ml di collagene di tipo I e 1 mg / mlIl laminino viene trasferito all'interno delle micro-TENN e permesso di polimerizzare. (Ii) A seconda che si producano micro-TENN unidirezionali o bidirezionali, un aggregato viene posto rispettivamente in uno o entrambi gli estremi della micro-colonna. (Iii) Dopo un periodo di incubazione per promuovere l'adesione, le micro-TENN vengono coltivate in piatti Petri inondati con un mezzo basale neuronale embrionale integrato. (Iv) Dopo 3-5 giorni di coltura, la struttura finale del micro-TENN dovrebbe dimostrare gli aggregati di cellule agli estremi della micro-colonna, con tracce assonali che coprono la sua lunghezza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

Tutte le procedure relative agli animali sono state approvate dai comitati istituzionali di cura degli animali presso l'Università di Pennsylvania e dal Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center e rispettano le linee guida stabilite dalla NIH Politica del Servizio Sanitario Pubblico sulla Humane Care and Use of Laboratory Animali (2015). 1. Sviluppo dell'idrogelo di agarosio (componente acellulare di micro-TENN) Preparazione della soluzione di agarosio</…

Representative Results

Le micro-TENN sono state monitorate usando la microscopia a fase-fase per valutare la loro citoarchitettura e la loro crescita assonale ( Figura 4 ). All'interno di micro-TENN unidirezionali di lunghezza di 2 mm, gli aggregati neuronali sono stati limitati ad una estremità della micro-colonna e hanno proiettato un fascio di assoni attraverso il nucleo interno. Axons ha percorso l'intera lunghezza della colonna di 5 giorni in vitro (DIV) ( Figura…

Discussion

La lesione e la malattia del CNS causano in genere la perdita o la disfunzione dei percorsi assonali a lunga distanza che comprendono il connettore del cervello, con o senza la degenerazione neuronale concomitante. Questo è aggravato dalla limitata capacità del CNS per promuovere la neurogenesi e la rigenerazione. Nonostante il perseguimento di strategie di riparazione come fattori di crescita, cellule e consegna biomateriali come approcci individuali o combinatoriali, queste tecniche non riescono contemporaneamente a…

Materials

Laser cutter	Universal Laser Systems	PLS4.75	Used to fabricate the laser-cut micro-channel mold.
Laser-cut micro-column fabrication device	Custom-made	————–	Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.
Screws	————–	————–	#4-40 with a thread diameter of 3.05 mm
Nuts	————–	————–	#4-40 with a thread diameter of 3.05 mm
Acupuncture needle (180 µm diameter)	Lhasa Medical	sj.16X40	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish	Fisher	08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)	Invitrogen	14200075
Polystyrene disposable serological pipet	Fisher	13-678-11D
Agarose	Sigma	A9539-50G
Capillary tube (398 µm diameter)	Fisher	21170D	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Hot plate	Fisher	SP88857200
Magnetic bar	Fisher	1451352
Micropipette	Sigma	Z683884-1EA
25 mm gauge needle	Fisher	14-826-49
Microscalpel	Roboz Surgical	RS-6270
Scissors	Fine Science Tools	14081-09
Forceps	World Precision Instruments	501985
Hot bead sterilizer	Sigma	Z378550-1EA
Stereoscope	Nikon	SMZ800N	Used for all dissection steps and for micro-TENN fabrication.
Rat tail type I collagen	Corning	354236	Maintain at 4 ºC and remove only when needed.  Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube	Fisher	02-681-256
Mouse laminin	Corning	354232	Maintain at 4 ºC and remove only when needed.  Use ice to preserve its temperature when in use.
Neurobasal medium	Invitrogen	21103049	Basal medium for the culture of pre-natal and embryonic neuronal cells. Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher	SS2661
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher	SA48-1
Litmus paper	Fisher	09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Invitrogen	14170112	Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (DNase) I	Sigma	10104159001	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 Supplement	Invitrogen	12587010	Supplement added to Neurobasal medium for the culture of hippocampal and cortical neurons. Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine	Invitrogen	35050061	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Sprague Dawley embryonic day 18 rats	Charles River	Strain 001
Pasteur pipette	Fisher	22-042816
15 mL centrifuge tube	EMESCO	1194-352099
Vortex	Fisher	02-215-414
Centrifuge	Fisher	05-413-115
Hemocytometer	Fisher	02-671-6
Objet30 3D-Printer	Stratasys	————–	Used to fabricate the pyramidal micro-well molds.
3D-printed pyramidal well mold	Custom-made	————–	Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.
Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent	Fisher	NC9285739	Comes as kit with elastomer and curing agent. Use inside a chemical fume hood.
Funnel	Fisher	10-348C
1 ml pipette bulb	Sigma	Z509035
Micro-spatula	Fisher	S50821
12-well culture plate	EMESCO	1194-353043
Oven	Fisher	11-475-154
Incubator	Fisher	13 998 076
AAV1.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40	UPenn Vector Core	36373	Store at -80ºC. Commercially available adeno-associated virus (AAV) with the GCaMP6f calcium indicator.
Formaldehyde 40%	Fisher	F77P-4	Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.
Triton X-100	Sigma	T8787	Non-ionic surfactant used to permeabilize cell membranes.
Horse serum	Gibco	16050-122
Mouse anti-Tuj-1/beta-III tubulin primary antibody	Sigma	T8578-200UL	Store at -20ºC.
Rabbit anti-synapsin 1 primary antibody	Synaptic Systems	106-001	Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody	Invitrogen	A10037	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody	Invitrogen	A21206	Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Invitrogen	H3570	Store at 4ºC.  Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen.  Therefore, it must be disposed of in a separate container.
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon	————–	Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope	Nikon	————–	Used for taking the phase-contrast images.  With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).
High-speed Fluorescence Microscope	Nikon	————–	Nikon Eclipse Ti microscope paired with an ANDOR Neo/Zyla camera for calcium imaging.
NIS Elements AR 4.50.00 Software	Nikon Instruments	————–	Used to identify calcium transients from the recordings taken with the high-speed fluorescence microscope.