Anatomisk inspirerte tredimensjonale mikrovev-konstruerte nevrale nettverk for nervesystemet Rekonstruksjon, modulering og modellering

Summary

Dette manuskriptet beskriver fremstillingen av mikrovev-manipulerte nevrale nettverk: tredimensjonale mikronstørrelses konstruksjoner bestående av langjusterte aksonale kanaler som spenner over aggregerte nevronpopulasjoner som er innkapslet i en rørformet hydrogel. Disse levende stillasene kan fungere som funksjonelle reléer for å rekonstruere eller modulere nevrale kretser eller som biofideliske test-senger som etterligner grå-hvitt materie-neuroanatomi.

Abstract

Funksjonell gjenoppretting forekommer sjelden etter skade eller sykdomsfremkalt degenerasjon i sentralnervesystemet (CNS) på grunn av det hemmende miljø og den begrensede kapasiteten for neurogenese. Vi utvikler en strategi for samtidig å behandle nevron- og axonal baneutslipp i det skadede CNS. Dette manuskriptet presenterer fremstillingsprotokollen for mikro-vev-konstruerte nevrale nettverk (mikro-tenner), implanterbare konstruksjoner som består av nevroner og justerte aksonale kanaler som spenner over den ekstracellulære matriksen (ECM) lumen av en forformet hydrogelcylinder, hundrevis av mikron i diameter som kan utvide sentimeter I lengde. Neuronale aggregater er avgrenset til ekstremer av den tredimensjonale innkapslingen og spennes av aksonale fremspring. Mikro-tenner er unikt posisjonert som en strategi for CNS rekonstruksjon, emulerende aspekter av hjernekobling cytoarchitecture og potensielt gir midler for nettverksutskifting. Den neuRonale aggregater kan synaps med vertsvev for å danne nye funksjonelle reléer for å gjenopprette og / eller modulere manglende eller skadet kretsløp. Disse konstruksjonene kan også fungere som pro-regenerative "levende stillas" som er i stand til å utnytte utviklingsmekanismer for celle-migrasjon og aksonal pathfinding, som gir synergistiske strukturelle og løselige signaler basert på regenereringsstatus. Mikro-tenner fremstilles ved å helle flytende hydrogel inn i en sylindrisk form som inneholder en langsgående sentrert nål. Når hydrogelen har gelert, blir nålen fjernet, og etterlater en hul mikrokolonne. En ECM-løsning legges til lumenet for å gi et miljø egnet for nevronal adhesjon og aksonal utvekst. Dissocierte nevroner er mekanisk aggregerte for presis sådd i en eller begge ender av mikrokolonnen. Denne metoden gir pålitelig selvbetjente miniatyrkonstruksjoner med langprojiserende aksonale kanaler som kan rekapitulere trekkegenskaper i hjernens neuroanatomi. Synaptisk immUnolabeling og genetisk kodede kalsiumindikatorer antyder at mikro-tenner har omfattende synaptisk fordeling og inneboende elektrisk aktivitet. Følgelig representerer mikro-tennene en lovende strategi for målrettet nevrokirurgisk rekonstruksjon av hjerneveier, og kan også brukes som biofideliske modeller for å studere neurobiologiske fenomener in vitro .

Introduction

En vanlig egenskap for lidelser og sykdommer i sentralnervesystemet (CNS), som traumatisk hjerneskade (TBI), ryggmargsskade (SCI), hjerneslag, Alzheimers sykdom og Parkinsons sykdom, er frakoblingen av aksonale veier og nevroncelle Tap ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6} . For eksempel, når et iskemisk slag går ubehandlet, anslås det at aksonene går tapt med en hastighet på 7 miles av axoner per minutt ⁵ . I tilfelle av TBI, som ca 1,7 millioner mennesker opplever hvert år i USA alene, kan aksonal degenerasjon fortsette å skje år etter traumer, da den første skaden utsettes for en langsiktig neurodegenerativ tilstand ⁴ . Forverrer disse skadelige effektene, har CNS en alvorlig begrenset capaBy for regenerering ^{1 , 7 , 8 , 9} . Etter skader utvikles et hemmende miljø som er preget av mangel på rettet veiledning til fjerne mål, tilstedeværelsen av myelin-assosierte hemmere som hindrer nevittutvæksten, og dannelsen av et glialær ved reaktive astrocytter ^{8 , 10 , 11 , 12} . Glialæret tjener som en biokjemisk og fysisk barriere for regenerering, med molekyler som kondroitinsulfatproteoglykaner som hindrer aksonutvokst ^{8 , 11} . Videre, selv om neurale stamceller er blitt funnet i den voksne CNS, er produksjonen av nye nevroner begrenset, da konsekvent bevis på nevrogenese kun er funnet i olfaktorisk pære, hippocampalSubgranulær sone, det periventrikulære området og den sentrale kanal i ryggmargen ^{13 , 14} . Disse hindringene hindrer den funksjonelle gjenoppretting av tapt nevroner og hvit materiell arkitektur etter skade eller sykdom, noe som resulterer i de ofte endringsmessige og langvarige effektene av disse forholdene.

Til tross for mangel på regenerativ kapasitet i den voksne CNS, har det vist seg at aksonal regenerering er mulig dersom tilstrekkelige miljøveiledninger presenteres for verten nevroner ^{15 , 16 , 17 , 18} . Forskere har forsøkt å levere og manipulere vekstfaktorer (for eksempel nervevækstfaktor, epidermal vekstfaktor, glialavhengig vekstfaktor og nevrotrofisk faktor 3) og andre veiledningsmolekyler for å stimulere plastisitet og axonregenerering ^{14 , <}/ Sup> ^{18 , 19} . Selv om disse studiene har bekreftet at voksenaksoner er i stand til å reagere på vekstfaktorer, er disse strategiene begrenset av lavt gjennomtrengelighet av blod-hjernebarrieren og de spesifikke romlige og tidsmessige gradienter som kreves for å fremme regenerering ^{14 , 18 , 19} . Andre tilnærminger har stått på hyperaktivering av regenereringsrelaterte transkripsjonsfaktorer i CNS-neuroner. For eksempel stimulerte overekspresjon av Stat3 transkripsjonsfaktoren aksonal regenerering i optisk nerve ²⁰ . Likevel unnlater både biomolekylavgivelse og overekspresjon av transkripsjonsfaktorer å erstatte tapte nevronpopulasjoner. Cell-baserte strategier har hovedsakelig sentrert seg på transplantasjon av neuralstamceller (NSC) i CNS, og utnytter deres evne til å erstatte CNS-neuroner, frigjøre trofiske faktorer,Og støtte forsøk på neurogenese som oppstår etter skade ¹⁷ . Til tross for dette er det fortsatt presserende utfordringer som hindrer denne tilnærmingen, inkludert den hindrede evne til transplanterte nevrale celler til å overleve, integrere med verten, og forblir romlig begrenset til det skadede område ^{6 , 14 , 17 , 21} . I tillegg er cellelevering alene ikke i stand til å gjenopprette cytoarkitekturen av skadede eller tapte aksonale veier. En alternativ tilnærming som løser problemene med celle- og stoff- / kjemisk leveringsstrategier, er å kombinere disse tilnærmingene med bruken av biomaterialene ^{14 , 22 , 23} . Biomaterialer som hydrogeler er i stand til å emulere de biokjemiske og fysiske egenskapene til den ekstracellulære matriksen (ECM), som bidrar til cellelevering ogD oppbevaring i det skadede området, og levere vekstfaktorer og andre bioaktive molekyler med kontrollert frigivelse ²² . De attraktive egenskapene til disse biomaterialebaserte strategiene har resultert i bevis på in vivo axonal regenerering etter transplantasjon av stillaser til det lesioned området ^{24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30} . Imidlertid erstatter acellulære biomaterialestrategier ikke tapte nevronpopulasjoner; Når de brukes som leveringsvogner for nevron-, glial- eller neuronprekursorceller, er biomaterialer ikke i stand til å rekonstruere langdistansaksonale nettverk. Utfordringen med å utvikle en tilnærming som takler både den aksonale banedegenerasjonen og nevrolog tap forbundet med CNS-skade og sykdom forblir fortsatt <Sup class = "xref"> 31.

Vår forskningsgruppe rapporterte tidligere utviklingen av implanterbare mikro-vev-konstruerte nevrale nettverk (mikro-tenner), som er en type "levende stillas" bestående av neuronelle celleorganer begrenset til en eller begge ender av en agarosehydrogel-ECM mikrosøjle , Med justerte aksonale kanaler som strekker seg gjennom det indre av denne tredimensjonale (3D) innkapslingen ^{1 , 10 , 31 , 32} . En av de viktigste forskjellene mellom denne teknikken og tidligere tilnærminger er at cytoarkitektur av mikro-tenner er opprettet helt in vitro og transplanteres etterpå ^{33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 ,} <Sup class = "xref"> 39 ^{, 40 , 41} . In vitro- fremstilling gir omfattende romlig og tidsmessig kontroll av cellulær fenotype og orientering, mekaniske / fysiske egenskaper, biokjemiske tegn og eksogene faktorer, noe som fordeler integrasjonen av disse stillasene med verten etter implantasjon ^{41 , 42} . Mikro-tenner er anatomisk inspirert fordi de etterligner hjernens neuroanatomi, viser aksonale kanaler som ligner de som knytter distinkte funksjonsområder av hjernen ( figur 1A ) ¹ . Derfor kan denne strategien fysisk erstatte tapte hvite materielle kanaler og nevroner etter implantasjon i en lesioned region. Denne teknikken er også inspirert av utviklingsmekanismer der "naturlige levende stillaser" dannet av radiale glialceller og banebrytende axoner fungerer som veiledende guider for celleMigrasjon fra subventricular sonen og aksonal utvekst, henholdsvis ⁴³ . Disse mekanismene er rekapitulert i de justerte aksonale kanaler av mikro-tenner, som kan presentere levende veier for nevralcellemigrasjon og aksonal regenerering ved akson-mediert aksonal utvekst ( figur 1C ) ⁴³ . Videre utnytter denne strategien seg av synaptisk integrasjon mellom mikro-TENN-neuronene og det nasjonale kretsløpet, og danner nye reléer som kan bidra til funksjonell gjenoppretting ( figur 1B ) ⁴³ . Kapasiteten til synapsdannelse kan også gi denne tilnærmingen muligheten til å modulere CNS og reagere på vertsvev i henhold til nettverks tilbakemelding. For eksempel kan optogenetisk aktive nevroner i levende stillasene stimuleres til å modulere vertsneuroner gjennom synaptiske interaksjoner ( Figur 1D ).

I tillegg er den biomaterialebaserte rørformede konstrUgn av mikro-tenner gir et tilstrekkelig miljø for celleadhesjon, vekst, neurittforlengelse og signalering, mens de minste dimensjonene av konstruksjonene muligens muliggjør minimal invasiv implantering og gir et delvis sekvestrert mikromiljø for gradvis integrering i hjernen. Faktisk har nyere publikasjoner vist potensialet for mikro-tenner til å etterligne nevrale veier etter implantasjon i rottehjerne. Etter stereotaksisk mikroinjeksjon rapporterte vi tidligere bevis for mikro-TENN-neuronal overlevelse, vedlikehold av aksonalkanalarkitektur, og nevittforlengelse i vertscortexen i minst 1 måned in vivo ^{10 , 31} . Dessuten ga merking med synapsin histologisk bevis på synaptisk integrasjon med nativt vev ^{10 , 31} . Samlet sett kan mikro-tenner være unikt egnet til å rekonstruere og modulere skadetCNS ved å erstatte tapte nevroner, synaptisk integrering med vertskretsløp, gjenopprette tapt axonal cytoarkitektur og i visse tilfeller å gi regenererende axoner med de riktige stikkordene.

Figur 1: Prinsipper og inspirasjon bak utviklingen av mikro-vev-konstruerte nevrale nettverk (mikro-tenner). ( A ) Mikro-Tenner etterligner cytoarkitekturen til hjernekoblingen (lilla), hvor funksjonelt forskjellige regioner er forbundet med lange, justerte aksonale kanaler i en retningsriktet (rød, grønn) eller toveis (blå) måte. Som et eksempel kan mikro-tenner rekonstruere tapte forbindelser i kortikothalamiske og nigrostriatale veier eller i perforantveien fra entorhinal cortex til hippocampus (tilpasset fra Struzyna et al. , 2015) ¹ . ( B ) Diagram over en enhetlig retningL og toveis mikro-TENN (henholdsvis rød og blå) synaptisk integrering med vertskretsen (lilla) for å fungere som et funksjonsrelé mellom begge ender av en lesjon. ( C ) Skjematisk av axonaltraktene i en ensrettet mikro-TENN (grønn) som tjener som en veiledning for aksonforenklet regenerering av vertsaxoner (lilla) mot et mål som mikro-tennene samhandler med. ( D ) Konseptbasert diagram for bruk av optogenetisk aktive mikro-TENNS som nervemodulatorer, utnytte synaptisk integrasjon med eksitatoriske eller hemmerende nevroner (bunn). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Det nåværende manuskriptet beskriver metoden som ble benyttet for å fremstille mikro-tenner ved bruk av embryonalt avledede cerebrale kortikale nevroner. Spesielt kan mikro-tenner fremstilles med andre typer nevrale celler. For eksempelRikelig, de første rapportene om vellykket mikro-TENN-utvikling inneholdt dorsal root ganglion (DRG) nevroner ³² . Hydrogelmikrokolonnene kan genereres ( figur 2A ) ved å tilsette flytende agarose til en skreddersydd, laser-kuttet sylindrisk kanalgruppe eller til kapillærrør, begge inneholdende justerte akupunkturnåler. Nålen danner lumenet og bestemmer mikrokolonnens indre diameter (ID), mens kapillærrøret ID og diameteren av sylindrene i den laserskårne anordningen dikterer den ytre diameter (OD) til konstruksjonene. OD og ID kan velges i henhold til ønsket søknad ved å velge forskjellige diametre for henholdsvis anordning / kapillærrør og akupunktur nåler. Lengden på mikrokolonnene kan også varieres; Til dags dato har vi rapportert bygging av mikro-tenner opptil 20 mm i lengde ¹⁰ og driver aktivt lengre lengder. Etter agarose geler og akupunktur nEedler fjernes, en ECM-løsning som vanligvis består av type I kollagen og laminin tilsettes i konstruksjonslumenet ( figur 2C ). ECM-kjernen gir et stillas for å understøtte nevroncelleadhesjon og aksonal utvekst. I første omgang ble primære rotte-kortikale nevroner plettet i mikrokolonnene ved anvendelse av dissocierte cellesuspensjoner ^{10 , 31 , 32} . Imidlertid produserte denne tilnærmingen ikke mål-cytoarkitekturen i alle tilfeller, som ble definert som neuronelle celleorganer begrenset til endene av mikrokolonnene, med det sentrale lumen bestående av renjusterte aksonale kanaler. Siden da har bruken av en tvungen neuronal aggregeringsmetode (basert på protokoller tilpasset Ungrin et al .) Gjort det mulig for en mer pålitelig og konsekvent fremstilling av mikro-tenner med den ideelle strukturen ( figur 2B ) ⁴⁴ . I tillegg til å beskrive dagensMetodikk, vil denne artikkelen vise representative fasekontrast og konfokale bilder av mikro-tenner som demonstrerer dannelsen av aksonale kanaler over tid, samt den ferdige mål-cytoarkitekturen. Dette manuskriptet vil også utvide på bemerkelsesverdige aspekter av protokollen og gjenværende utfordringer og fremtidige retninger av mikro-TENN teknologien.

Figur 2: Skjematisk diagram av tre-trinns mikro-TENN fabrikasjonsprosess. ( A ) Utvikling av agarosehydrogelen: (i) Først settes en liten akupunkturnål ( f.eks . 180-350 μm i diameter) inn i de sylindriske kanalene i en skreddersydd, laserskåret form eller et kapillarrør ( f.eks. , Diameter 380-700 μm). I det neste trinnet blir flytende agarose i DPBS introdusert i de sylindriske kanalene eller kapillærrørene. (Ii) Etter agarose gelene fjernes nålen ogFormen er demontert for å gi de hule agarosemikolonner. (Iii) Disse konstruksjonene steriliseres deretter og lagres i DPBS. ( B ) Primærnekonkultur og aggregatmetode: (i) Neuronal aggregering utføres i pyramidale mikrobrønn-arrays, støpt av 3D-trykte støper, som passer inn i brønnene på en 12-brønn kulturplate. (Ii) Mikro-TENNer inkluderer primære rotte-neuroner dissosiert fra føtalhjerner av embryonaldag-18-rotter. Etter vevsdissociasjon med trypsin-EDTA og DNase I fremstilles en celleoppløsning med en densitet på 1,0-2,0 x ¹⁰⁶ celler / ml. (Iii) 12 μl av denne løsningen overføres til hver brønn i den pyramide mikrobrønn array. Platen som inneholder disse mikrobrønnene, blir sentrifugert for å produsere celleaggregater. (Iv) Disse inkuberes deretter over natten før plating i mikrokolonnene. ( C ) ECM-kjernefabrikasjon og cellesøing: (i) Før cellesøing ble en ECM-løsning inneholdende 1 mg / ml type I kollagen og 1 mg / mlLaminin overføres til det indre av mikro-tennene og får lov til å polymerisere. (Ii) Avhengig av om enveis eller toveis mikro-TENN er tilveiebragt, blir et aggregat plassert ved henholdsvis en eller begge ytterpunkter av mikrokolonnen. (Iii) Etter en inkuberingsperiode for å fremme vedheft blir mikro-TENN dyrket i petriskåler oversvømt med supplert embryonalt nevronbasalt medium. Iv) Etter 3-5 dager i kultur bør den endelige mikro-TENN-strukturen demonstrere celleaggregater ved ekstremer av mikrokolonnen, med aksonale kanaler som strekker seg over lengden. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

Alle prosedyrer som involverer dyr ble godkjent av Institusjonelle dyrepleie- og brukskomiteer ved University of Pennsylvania og Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center og fulgte retningslinjene i NIHs folkehelsepolitiske retningslinjer for human omsorg og bruk av laboratorium Dyr (2015). 1. Utvikling av agarosehydrogelen (akellulær komponent av mikro-tenner) Agaroseoppløsningspreparat Innenfor et biosikkerhetskapasitet skal du lagre reservo…

Representative Results

Mikro-tenner ble overvåket ved bruk av faskontrastmikroskopi for å vurdere deres cytoarkitektur og aksonal utvekst ( figur 4 ). Innen unidirectional, 2 mm lange mikro-TENN ble neuronalaggregater begrenset til den ene enden av mikrokolonnen og projiserte en bunke av aksoner gjennom den indre kjerne. Axons spredde hele lengden av kolonnen med 5 dager in vitro (DIV) ( figur 4A ). Det var en større innledende aksonal vekstrate i toveis 2 mm lange…

Discussion

CNS-skade og sykdom resulterer vanligvis i tap eller dysfunksjon av langdistansaksonalbanene som omfatter hjernekoblingen, med eller uten samtidig neuronal degenerasjon. Dette forsterkes av den begrensede kapasiteten til CNS for å fremme neurogenese og regenerering. Til tross for jakten på reparasjonsstrategier som vekstfaktor, celle og biomateriallevering som individuelle eller kombinatoriske tilnærminger, feiler disse teknikkene samtidig ikke for både degenerasjonen av nevronceller og tapet av aksonale forbindelse…

Materials

Laser cutter	Universal Laser Systems	PLS4.75	Used to fabricate the laser-cut micro-channel mold.
Laser-cut micro-column fabrication device	Custom-made	————–	Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.
Screws	————–	————–	#4-40 with a thread diameter of 3.05 mm
Nuts	————–	————–	#4-40 with a thread diameter of 3.05 mm
Acupuncture needle (180 µm diameter)	Lhasa Medical	sj.16X40	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish	Fisher	08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)	Invitrogen	14200075
Polystyrene disposable serological pipet	Fisher	13-678-11D
Agarose	Sigma	A9539-50G
Capillary tube (398 µm diameter)	Fisher	21170D	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Hot plate	Fisher	SP88857200
Magnetic bar	Fisher	1451352
Micropipette	Sigma	Z683884-1EA
25 mm gauge needle	Fisher	14-826-49
Microscalpel	Roboz Surgical	RS-6270
Scissors	Fine Science Tools	14081-09
Forceps	World Precision Instruments	501985
Hot bead sterilizer	Sigma	Z378550-1EA
Stereoscope	Nikon	SMZ800N	Used for all dissection steps and for micro-TENN fabrication.
Rat tail type I collagen	Corning	354236	Maintain at 4 ºC and remove only when needed.  Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube	Fisher	02-681-256
Mouse laminin	Corning	354232	Maintain at 4 ºC and remove only when needed.  Use ice to preserve its temperature when in use.
Neurobasal medium	Invitrogen	21103049	Basal medium for the culture of pre-natal and embryonic neuronal cells. Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher	SS2661
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher	SA48-1
Litmus paper	Fisher	09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Invitrogen	14170112	Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (DNase) I	Sigma	10104159001	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 Supplement	Invitrogen	12587010	Supplement added to Neurobasal medium for the culture of hippocampal and cortical neurons. Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine	Invitrogen	35050061	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Sprague Dawley embryonic day 18 rats	Charles River	Strain 001
Pasteur pipette	Fisher	22-042816
15 mL centrifuge tube	EMESCO	1194-352099
Vortex	Fisher	02-215-414
Centrifuge	Fisher	05-413-115
Hemocytometer	Fisher	02-671-6
Objet30 3D-Printer	Stratasys	————–	Used to fabricate the pyramidal micro-well molds.
3D-printed pyramidal well mold	Custom-made	————–	Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.
Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent	Fisher	NC9285739	Comes as kit with elastomer and curing agent. Use inside a chemical fume hood.
Funnel	Fisher	10-348C
1 ml pipette bulb	Sigma	Z509035
Micro-spatula	Fisher	S50821
12-well culture plate	EMESCO	1194-353043
Oven	Fisher	11-475-154
Incubator	Fisher	13 998 076
AAV1.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40	UPenn Vector Core	36373	Store at -80ºC. Commercially available adeno-associated virus (AAV) with the GCaMP6f calcium indicator.
Formaldehyde 40%	Fisher	F77P-4	Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.
Triton X-100	Sigma	T8787	Non-ionic surfactant used to permeabilize cell membranes.
Horse serum	Gibco	16050-122
Mouse anti-Tuj-1/beta-III tubulin primary antibody	Sigma	T8578-200UL	Store at -20ºC.
Rabbit anti-synapsin 1 primary antibody	Synaptic Systems	106-001	Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody	Invitrogen	A10037	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody	Invitrogen	A21206	Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Invitrogen	H3570	Store at 4ºC.  Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen.  Therefore, it must be disposed of in a separate container.
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon	————–	Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope	Nikon	————–	Used for taking the phase-contrast images.  With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).
High-speed Fluorescence Microscope	Nikon	————–	Nikon Eclipse Ti microscope paired with an ANDOR Neo/Zyla camera for calcium imaging.
NIS Elements AR 4.50.00 Software	Nikon Instruments	————–	Used to identify calcium transients from the recordings taken with the high-speed fluorescence microscope.