انقسام الخلية الثديية في مصفوفات ثلاثية الأبعاد عن طريق الفحص المجهري انعكاس [كنفوكل] الكمية
Summary
هذا البروتوكول الدراسات كفاءة انقسام الخلايا الثديية في مصفوفات الكولاجين 3D من خلال دمج تزامن انقسام الخلية، رصد الأحداث شعبة في مصفوفات ثلاثية الأبعاد باستخدام تقنية التصوير خلية يعيش، حل وقت التأمل [كنفوكل] مجهرية والتحليل الكمي للتصوير.
Abstract
دراسة كيف الثدييات انقسام الخلية وينظم في 3D البيئة لا تزال غير مستكشفة إلى حد كبير على الرغم من أهميتها الفسيولوجية وأهمية علاجية. الأسباب المحتملة لعدم وجود الاستكشاف هي تجريبية القيود والتحديات التقنية التي تجعل دراسة انقسام الخلايا في ثقافة 3D غير فعالة. هنا، يمكننا وصف أسلوب المستندة إلى تصوير لدراسة كفاءة انقسام الخلايا الثديية وتفاعلات الخلية-مصفوفة في مصفوفات الكولاجين 3D. الخلايا المسماة الفلورسنت H2B متزامنة باستخدام مزيج العلاج حجب ونوكودازولي thymidine، متبوعاً بأسلوب يهز قبالة ميكانيكية. ثم يتم تضمين الخلايا متزامنة في مصفوفة 3D الكولاجين. ويتم رصد انقسام الخلية باستخدام الفحص المجهري خلية يعيش. تشوه ألياف الكولاجين أثناء وبعد انقسام الخلايا، ومؤشر على تفاعل الخلية-مصفوفة، يمكن رصدها وقياسها كمياً باستخدام الانعكاس [كنفوكل] كمية مجهرية. الأسلوب يقدم نهجاً تتسم بالكفاءة وعامة لدراسة الثدييات انقسام الخلية والتفاعلات الخلية-مصفوفة في بيئة ثلاثية الأبعاد ذات صلة فسيولوجيا. هذا النهج يوفر نظرة ثاقبة رواية الأساس الجزيئي لتنمية أنسجة طبيعية والأمراض، بل يسمح أيضا لتصميم نهج جديدة في التشخيص والعلاج.
Introduction
الانقسام الخلية هو حدث حاسم في الحياة الخلوية، واللائحة التي تلعب أدواراً حاسمة في تطوير الجهاز والأنسجة. الانقسام الشاذ المتورطة في الاختلافات الوراثية الطبيعية، وعمليات الشيخوخة البشرية وتطور السرطان1،2،3،،من45. زيادة معدل انتشار الخلايا السرطانية بالمقارنة مع الخلايا الطبيعية واحدة من السمات المميزة للسرطان، على الرغم من أن سلوك الخلية غير متجانسة تماما بين أنواع مختلفة من الأورام، وحتى بين المرضى. على الرغم من النتائج السريرية الواعدة، لم تظهر بعض العقاقير أنتيميتوتيك المطورة حديثا لتكون فعالة في التجارب السريرية6،،من78،9،10 ،11. وقد أهمية النماذج التجريبية والاكلينيكية التي سينظر فيها. تقسيم أنواع عديدة من خلايا الثدييات والسرطان العادي في المصفوفات (3D) ثلاثي الأبعاد، مثل الخلايا الليفية والخلايا فيبروساركوما في الأنسجة الضامة 3D-الأغنياء من الكولاجين وخلايا السرطان المنتشر في المصفوفة خارج الخلية stromal 3D (ECM). ومع ذلك، تم إجراء الغالبية العظمى من انقسام الخلية الثديية التجارب والاختبارات على الخلايا المزروعة في ثنائي الأبعاد (2D) ركائز. أفضل يمكن أن الخص مصفوفة 3D هندستها المجهرية، والخصائص الميكانيكية والإشارات البيوكيميائية من المحتوى ثلاثي الأبعاد لكل أنسجة طبيعية ومرضية12،،من1314، 1516،،17.
دراسة كيف الثدييات انقسام الخلية وينظم في 3D بيئات لا تزال غير مستكشفة إلى حد كبير على الرغم من أهميتها الفسيولوجية وال18،الأهمية العلاجية19. تتضمن الأسباب المحتملة بالصعوبات التقنية والتجريبية التحديات المرتبطة بدراسة انقسام الخلية في مصفوفات ثلاثية الأبعاد. يشكل الانقسام الخلية صغيراً الزمانية في20دورة الخلية بأكملها. العمل السابقة قد أظهرت أن معدل انتشار العديد من خلايا الثدييات، مثل غدية الثدي البشري MCF-7، أوستيوساركوما البشرية U2OS والكبد البشري HepG2، أقل بكثير في مصفوفات ثلاثية الأبعاد بالمقارنة مع نظرائهم في 2D ركائز21، 22. وعلاوة على ذلك، نقل الخلايا المضمنة في مصفوفات ثلاثية الأبعاد داخل وخارج التركيز أثناء تصوير خلية يعيش. وكل هذه العوامل تسهم في كفاءة منخفضة للغاية لالتقاط أحداث انقسام الخلايا في ثقافة ثلاثي الأبعاد باستخدام تقنيات التصوير.
التفاعلات بين إدارة المحتوى في المؤسسة والخلايا تلعب أدواراً حاسمة في تنظيم انقسامات الخلية. هنا، يمكننا وصف نهج لدراسة كفاءة انقسام الخلايا الثديية في مصفوفات الكولاجين 3D. يتضمن الأسلوب إدراج علامات الانقسامية للخلايا، وتزامن انقسام الخلية، فضلا عن رصد أحداث شعبة في مصفوفات ثلاثية الأبعاد باستخدام تقنية التصوير خلية يعيش، حل وقت التأمل [كنفوكل] مجهرية، و التحليل الكمي للتصوير. أولاً أدخلت البروتين المسمى fluorescence هيستون H2B الخلايا كعلامة لتمييز الانقسامية والطور البيني خلايا. ثم تتم مزامنة الخلايا باستخدام مزيج العلاج حجب ونوكودازولي thymidine، متبوعاً بأسلوب يهز قبالة ميكانيكية. ثم يتم تغليف الخلايا متزامنة مباشرة إلى مصفوفات الكولاجين 3D. وترصد أحداث انقسام الخلية من خلايا متعددة كفاءة استخدام التصوير خلية يعيش الوقت الفاصل بين تضخم منخفض. ويتم رصد تشوه ألياف الكولاجين، ومؤشر على تفاعل الخلية-مصفوفة، استخدام الانعكاس [كنفوكل] مجهرية في عالية التكبير.
وقد استخدمنا هذا الأسلوب سابقا لرصد وقياس التفاعل خلية المصفوفة قبل وأثناء وبعد الانقسام اثنين من خطوط خلايا السرطان المنتشر وسرطان الأقنية الغازية البشرية MDA-ميغابايت-231 والخلايا البشرية فيبروساركوما HT1080، في الكولاجين 3D 19من المصفوفات. الأساليب المقدمة هنا توفير نهج فعالة والعامة لدراسة كل انقسام الخلية الثدييات في التفاعلات بين البيئة وخلية-مصفوفة 3D. يتم استخدام خط الخلية MDA-ميغابايت-231 كمثال في جميع أنحاء الورقة. هذا البروتوكول يوفر نظرة ثاقبة رواية الأساس الجزيئي لتنمية أنسجة طبيعية والأمراض، ويمكن أن تسمح أيضا بتصميم نهج جديدة في التشخيص والعلاج.
Protocol
Representative Results
Discussion
الدراسة السابقة لانقسام الخلية في 3D لم تكن فعالة بسبب القيود التجريبية والتحديات التقنية18،19. الخطوات الحاسمة لدراسة كفاءة الانقسام الخلوي الثدييات في مصفوفات الكولاجين 3D: (1) إدماج الأسفار المسماة علامات الانقسامية للخلايا؛ (2) تزامن انقسام الخلية؛ و (3) رصد…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان يدعمها في المعاهد الوطنية للصحة ويمنح R01CA174388 و U54CA143868. الكتاب تود أن تقر منح بورا من جامعة جون هوبكنز للدعم لتشن وي-تونغ. ويستند إلى العمل المدعوم من “زمالة البحوث الدراسات العليا مؤسسة العلوم الوطنية” تحت رقم المنحة 1232825 هذه المواد.
Materials
| Human embryonic kidney 293T | ATCC | ||
| MDA-MB-231 | Physical Sciences Oncology Center, NIH | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM powder | ThermoFisher Scientific | 12100-046 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Penicillin-Streptomycin 100X | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Fugene HD | Promega | E2311 | |
| Lipofectamine 2000 | Life technologies | 11668-07 | |
| Plasmid encoding H2B-mCherry in a lentiviral vector | Addgene | plasmid 21217 | |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895 | |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | |
| Sodium bicarbonate | GibcoBRL | 11810-025 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 113375-100 | |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| NaOH | J.T. Bake | 3722-01 | |
| Millex-HV syringe filter unit, 0.45-μm, PVDF, 33 mm | Millipore | SLHVM33RS | |
| Nikon TE2000E epifluorescence microscope | Nikon | TE2000E | |
| Cascade 1K CCD camera | Roper Scientific | ||
| NIS-Elements AR imaging software | Nikon | ||
| Nikon A1 confocal microscope | Nikon | A1 |
References
- Ly, D. H., Lockhart, D. J., Lerner, R. A., Schultz, P. G. Mitotic misregulation and human aging. Science. 287 (5462), 2486-2492 (2000).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?. J Cell Sci. 122 (Pt 15), 2579-2585 (2009).
- Brinkley, B. R. Managing the centrosome numbers game: from chaos to stability in cancer cell division. Trends Cell Biol. 11 (1), 18-21 (2001).
- Phillip, J. M., Aifuwa, I., Walston, J., Wirtz, D. The Mechanobiology of Aging. Annu Rev Biomed Eng. 17, 113-141 (2015).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Martin, M. D., et al. Effect of ablation or inhibition of stromal matrix metalloproteinase-9 on lung metastasis in a breast cancer model is dependent on genetic background. Cancer Res. 68 (15), 6251-6259 (2008).
- Knox, J. J., Hotte, S. J., Kollmannsberger, C., Winquist, E., Fisher, B., Eisenhauer, E. A. Phase II study of Triapine in patients with metastatic renal cell carcinoma: a trial of the National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group (NCIC IND.161). Invest New Drugs. 25 (5), 471-477 (2007).
- Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D. L., Fojo, A. T. Inhibitors targeting mitosis: tales of how great drugs against a promising target were brought down by a flawed rationale. Clin Cancer Res. 18 (1), 51-63 (2012).
- Tong, W. G., et al. Phase I and pharmacologic study of SNS-032, a potent and selective Cdk2, 7, and 9 inhibitor, in patients with advanced chronic lymphocytic leukemia and multiple myeloma. J Clin Oncol. 28 (18), 3015-3022 (2010).
- Matulonis, U. A., et al. Phase II study of MLN8237 (alisertib), an investigational Aurora A kinase inhibitor, in patients with platinum-resistant or -refractory epithelial ovarian, fallopian tube, or primary peritoneal carcinoma. Gynecol Oncol. 127 (1), 63-69 (2012).
- Boss, D. S., et al. Clinical evaluation of AZD1152, an i.v. inhibitor of Aurora B kinase, in patients with solid malignant tumors. Ann Oncol. 22 (2), 431-437 (2011).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (3), 211-224 (2006).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression. J Cell Biol. 196 (4), 395-406 (2012).
- Giri, A., et al. The Arp2/3 complex mediates multigeneration dendritic protrusions for efficient 3-dimensional cancer cell migration. FASEB J. 27 (10), 4089-4099 (2013).
- Fraley, S. I., Feng, Y., Giri, A., Longmore, G. D., Wirtz, D. Dimensional and temporal controls of three-dimensional cell migration by zyxin and binding partners. Nat Commun. 3, 719 (2012).
- Fraley, S. I., et al. A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility. Nat Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).
- Lesman, A., Notbohm, J., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Contractile forces regulate cell division in three-dimensional environments. J Cell Biol. 205 (2), 155-162 (2014).
- He, L., et al. Local 3D matrix confinement determines division axis through cell shape. Oncotarget. 7 (6), 6994-7011 (2016).
- Held, M., et al. CellCognition: time-resolved phenotype annotation in high-throughput live cell imaging. Nat Methods. 7 (9), 747-754 (2010).
- Fallica, B., Maffei, J. S., Makin, G., Zaman, M. Alteration of cellular behavior and response to PI3K pathway inhibition by culture in 3D collagen gels. PLoS One. 7 (10), e48024 (2012).
- Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems. Biomaterials. 33 (35), 9087-9096 (2012).
- Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Curr Protoc Cell Biol. 10, 1-20 (2010).
- Gunzer, M., Kampgen, E., Brocker, E. B., Zanker, K. S., Friedl, P. Migration of dendritic cells in 3D-collagen lattices. Visualisation of dynamic interactions with the substratum and the distribution of surface structures via a novel confocal reflection imaging technique. Adv Exp Med Biol. 417, 97-103 (1997).
- Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D. J Vis Exp. (80), e50763 (2013).
- Lleres, D., James, J., Swift, S., Norman, D. G., Lamond, A. I. Quantitative analysis of chromatin compaction in living cells using FLIM-FRET. J Cell Biol. 187 (4), 481-496 (2009).
- Poincloux, R., et al. Contractility of the cell rear drives invasion of breast tumor cells in 3D Matrigel. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (5), 1943-1948 (2011).
- Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
- Langan, T. J., Chou, R. C. Synchronization of mammalian cell cultures by serum deprivation. Methods Mol Biol. 761, 75-83 (2011).
- Jackman, J., O’Connor, P. M. Methods for synchronizing cells at specific stages of the cell cycle. Curr Protoc Cell Biol. 8, (2001).
- Zwanenburg, T. S. Standardized shake-off to synchronize cultured CHO cells. Mutat Res. 120 (2-3), 151-159 (1983).
- Harper, J. V. Synchronization of cell populations in G1/S and G2/M phases of the cell cycle. Methods Mol Biol. 296, 157-166 (2005).
- Kihara, T., Ito, J., Miyake, J. Measurement of biomolecular diffusion in extracellular matrix condensed by fibroblasts using fluorescence correlation spectroscopy. PLoS One. 8 (11), e82382 (2013).
- Ramanujan, S., et al. Diffusion and convection in collagen gels: implications for transport in the tumor interstitium. Biophys J. 83 (3), 1650-1660 (2002).
- Harjanto, D., Maffei, J. S., Zaman, M. H. Quantitative analysis of the effect of cancer invasiveness and collagen concentration on 3D matrix remodeling. PLoS One. 6 (9), e24891 (2011).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 931-941 (2009).
- Petroll, W. M. Differential interference contrast and confocal reflectance imaging of collagen organization in three-dimensional matrices. Scanning. 28 (6), 305-310 (2006).
- Fraley, S. I., et al. Three-dimensional matrix fiber alignment modulates cell migration and MT1-MMP utility by spatially and temporally directing protrusions. Sci Rep. 5, 14580 (2015).
- Ikeda, Y., Collins, M. K., Radcliffe, P. A., Mitrophanous, K. A., Takeuchi, Y. Gene transduction efficiency in cells of different species by HIV and EIAV vectors. Gene Ther. 9 (14), 932-938 (2002).
- Ma, H. T., Poon, R. Y. Synchronization of HeLa cells. Methods Mol Biol. 761, 151-161 (2011).
