Divisione delle cellule dei mammiferi in matrici 3D tramite microscopia confocale quantitativa di riflessione
Summary
Questo protocollo studia in modo efficiente divisione cellulare dei mammiferi in matrici di collagene 3D integrando sincronizzazione della divisione cellulare, monitoraggio degli eventi di divisione in matrici 3D utilizzando la tecnica di imaging cellule vive, microscopia risolta in tempo di riflessione confocale e quantitative analisi di imaging.
Abstract
Lo studio di mammifero come la divisione cellulare è regolato in un 3D ambiente rimane in gran parte inesplorata, nonostante la sua rilevanza fisiologica e significato terapeutico. Motivi possibili per la mancanza di esplorazione sono i limiti sperimentali e le sfide tecniche che rendono lo studio di divisione delle cellule in cultura 3D inefficiente. Qui, descriviamo un metodo basato su formazione immagine per studiare in modo efficiente divisione cellulare dei mammiferi e delle interazioni cellula-matrice in matrici di collagene 3D. Cellule identificate con H2B fluorescenti vengono sincronizzate utilizzando la combinazione di trattamento blocco e nocodazole della timidina, seguita da una tecnica di shake-off meccanica. Sincronizzate le cellule vengono quindi incorporate in una matrice di collagene 3D. Divisione cellulare viene monitorata tramite microscopia di cellule vive. La deformazione delle fibre del collagene durante e dopo la divisione cellulare, che è un indicatore di interazione cellula-matrice, possa essere monitorata e quantificati tramite microscopia confocale quantitativa di riflessione. Il metodo fornisce un approccio efficiente e generale per studiare la divisione delle cellule dei mammiferi e delle interazioni cellula-matrice in un ambiente 3D fisiologicamente rilevante. Questo approccio non solo fornisce le comprensioni novelle nella base molecolare dello sviluppo del tessuto normale e malattie, ma permette anche per la progettazione di nuovi approcci diagnostici e terapeutici.
Introduction
Mitosi delle cellule sono un evento critico nella vita cellulare, il regolamento di cui svolge un ruolo cruciale nello sviluppo di tessuti ed organi. Mitosi anomale sono implicato in variazioni genetiche naturali, processi di invecchiamento umano e la progressione del cancro1,2,3,4,5. Dell’aumento del tasso di proliferazione delle cellule tumorali rispetto alle cellule normali è uno dei tratti distintivi del cancro, nonostante il fatto che i comportamenti delle cellule sono piuttosto eterogenei tra diversi tipi di tumori e anche fra i pazienti. Nonostante i promettenti risultati preclinici, alcuni farmaci antimitotici recente sviluppato non hanno dimostrato di essere efficace in studi clinici6,7,8,9,10 ,11. La rilevanza dei modelli preclinici e sperimentale deve essere considerato. Molti tipi di cellule di cancro e mammiferi normali si dividono in tridimensionale (3D) matrici, come fibroblasti e cellule di fibrosarcoma in tessuti connettivi 3D-ricchi di collagene e cellule tumorali metastatiche in 3D stromal matrice extracellulare (ECM). Tuttavia, la stragrande maggioranza degli esperimenti di divisione delle cellule dei mammiferi e saggi è stata effettuata su cellule coltivate su substrati di bidimensionale (2D). Una matrice 3D ingegnerizzata potrebbe meglio ricapitolare la microstruttura, proprietà meccaniche e segnali biochimici della ECM 3D di entrambi tessuti normali e patologici12,13,14, 15,16,17.
Lo studio di mammifero come la divisione cellulare è regolato in 3D ambienti rimane in gran parte inesplorata, nonostante sia la rilevanza fisiologica e il significato terapeutico18,19. Possibili cause sono le difficoltà tecniche e sperimentali sfide connesse con lo studio di divisione cellulare in matrici 3D. Mitosi delle cellule costituiscono una piccola frazione temporale nell’ intero ciclo cellulare20. Il lavoro precedente ha indicato che il tasso di proliferazione delle cellule di molti mammiferi, come adenocarcinoma umano del seno MCF-7, osteosarcoma umano U2OS e fegato umano HepG2, è molto più bassa in matrici 3D rispetto alle loro controparti su substrati 2D21, 22. Inoltre, cellule incorporate in matrici 3D muovono dentro e fuori la messa a fuoco durante la formazione immagine di cellule vive. Tutti questi fattori contribuiscono all’efficienza estremamente bassa di acquisizione degli eventi di divisione delle cellule in cultura 3D usando tecniche di imaging.
Interazioni tra ECM e cellule giocano un ruolo critico nella regolazione di divisioni cellulari. Qui, descriviamo un metodo per studiare in modo efficiente divisione cellulare dei mammiferi in matrici di collagene 3D. Il metodo comprende l’incorporazione di marcatori mitotici delle cellule, sincronizzazione di divisione delle cellule, come pure il monitoraggio degli eventi di divisione in matrici 3D utilizzando la tecnica di imaging di cellule vive, risolta in tempo di riflessione confocale microscopia, e analisi quantitativa di imaging. Proteina di fluorescenza-labeled istone H2B è introdotto nelle cellule come un marcatore di differenziare mitotica e cellule di interfase. Quindi le cellule vengono sincronizzate utilizzando la combinazione di trattamento blocco e nocodazole della timidina, seguita da una tecnica di shake-off meccanica. Cellule sincronizzate sono quindi direttamente incapsulate in matrici di collagene 3D. Eventi di divisione cellulare delle cellule più sono monitorati in modo efficiente utilizzando basso ingrandimento time-lapse cellule vive imaging. La deformazione delle fibre del collagene, che è un indicatore di interazione cellula-matrice, è controllata mediante microscopia confocale riflessione alle ad alto ingrandimento.
In precedenza abbiamo usato questa tecnica per monitorare e quantificare l’interazione cellula-matrice prima, durante e dopo la mitosi di due linee cellulari di cancro metastatico, il carcinoma ductal dilagante umano MDA-MB-231 e cellule di fibrosarcoma umano HT1080, in collagene 3D matrici19. I metodi qui presentati forniscono un approccio efficiente e generale per studiare entrambi divisione cellulare dei mammiferi in un ambiente 3D interazioni cellula-matrice. La linea di cellule MDA-MB-231 è utilizzata come esempio in tutto il libro. Questo protocollo fornisce le comprensioni novelle nella base molecolare dello sviluppo del tessuto normale e malattie e potrebbe anche consentire per la progettazione di nuovi approcci diagnostici e terapeutici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il precedente studio di divisione cellulare in 3D non era efficiente a causa di limiti sperimentali e sfide tecniche18,19. I passaggi critici per efficiente studio di divisione delle cellule dei mammiferi in matrici di collagene 3D sono: (1) l’incorporazione di fluorescenza-labeled mitotici marcatori per le cellule; (2) la sincronizzazione della divisione cellulare; e (3) il monitoraggio degli eventi di divisione in matrici 3D utilizzando la tecnica di imaging di…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da NIH concede R01CA174388 e U54CA143868. Gli autori si desidera ringraziare il premio PURA della Johns Hopkins University per il supporto di Chen Wei-tong. Questo materiale si basa su lavori sostenuta dalla National Science Foundation Graduate Research Fellowship sotto Grant n. 1232825.
Materials
| Human embryonic kidney 293T | ATCC | ||
| MDA-MB-231 | Physical Sciences Oncology Center, NIH | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM powder | ThermoFisher Scientific | 12100-046 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Penicillin-Streptomycin 100X | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Fugene HD | Promega | E2311 | |
| Lipofectamine 2000 | Life technologies | 11668-07 | |
| Plasmid encoding H2B-mCherry in a lentiviral vector | Addgene | plasmid 21217 | |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895 | |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | |
| Sodium bicarbonate | GibcoBRL | 11810-025 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 113375-100 | |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| NaOH | J.T. Bake | 3722-01 | |
| Millex-HV syringe filter unit, 0.45-μm, PVDF, 33 mm | Millipore | SLHVM33RS | |
| Nikon TE2000E epifluorescence microscope | Nikon | TE2000E | |
| Cascade 1K CCD camera | Roper Scientific | ||
| NIS-Elements AR imaging software | Nikon | ||
| Nikon A1 confocal microscope | Nikon | A1 |
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